HPLC法同时测定白芍中5种成分含量

张嘉嘉，马 迟，朱志灵，张松柏，张 勋

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

白芍为毛莨科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的功效［1］，主要分布于安徽、浙江、四川等地［2］。其主要有效成分为芍药苷、芍药内酯苷以及没食子酸等［3］，具有保肝、抗炎、抗风湿、免疫调节功能等药理作用［4］。芍药苷和芍药内酯苷是白芍众多成分中公认的药效物质，以前者含量最高；芍药内酯苷为芍药苷的同分异构体，在补血、抗抑郁、糖尿病潜在治疗方面具有优于芍药苷的药效特点［5］；没食子酸具有抗炎的作用［6］。2015版《中华人民共和国药典》仅以芍药苷作为含量测定的指标性成分，成分单一，专属性不强，不足以反映白芍的总体质量。钱珺等［7］采用HPLC法同时测定白芍颗粒中的5种成分，以乙腈与0.1%磷酸为流动相，但考虑到该流动相体系对色谱柱和仪器损伤较大，希望可以探索出更好的流动相体系。因此本文收集了20批白芍饮片及药材，采用HPLC法对其所含的没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖5种成分进行测定，以期为提高白芍质量控制提供科学依据。

1 实验材料

1.1 实验仪器 AR224CN型电子分析天平（常州奥豪斯仪器有限公司）；EX225DZH型电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；KQ-500DE型医院数控超声清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；安捷伦1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）。

1.2 实验材料 白芍对照药材（中国食品药品质量检定研究院，批号：120905-201109）；没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷（上海源叶生物科技有限公司，批号：B20851、YY90574、YY90477、B21148）；β-五没食子酰葡萄糖（上海麦克林生化科技有限公司，批号：P816672）；甲醇、甲酸、乙腈均为色谱纯（默克化工技术有限公司）；实验用水皆为实验室蒸馏水。20批白芍样品信息见表 1（其中1～19号均经过福建中医药大学药学院黄泽豪老师鉴定，均为白芍饮片；20号为白芍对照药材）。

表1 20批白芍样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性 Welch Ultimate®XB-C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈（A）-0.05%甲酸（B）。 梯度洗脱：0～10 min，5%～10%A；10～30 min，10%～15%A；30～45 min，15%～30%A。 流速1 mL／min；检测波长 230 nm；柱温 30℃；进样量5 μL。各峰的分离度均大于1.5。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖适量，加甲醇超声溶解后分别制成346.8、319.6、222.0、366.8、353.6 μg／mL 的对照品储备液。 分别精密吸取对照品储备液适量，用甲醇稀释得每1 mL含 86.7、79.9、55.5、91.7 和 88.4 μg 上述 5 种成分的混合对照品溶液，保存于4℃冰箱中备用。

2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末过80目筛，精密称取0.25 g，置25 mL具塞三角烧瓶中，精密加入75%甲醇后超声处理（功率240 W，温度60℃）30 min，放冷，补足失重。过0.45 μm滤膜，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线 精密吸取“2.2”项下的混合对照品储备液于20 mL量瓶中，依次对半稀释得5组不同浓度的对照品混合液，编号 1～6。按“2.1”项测定。以对照品的浓度（μg／mL）为横坐标（X），峰面积（mAU）为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数，结果见表2。

表2 5种成分的线性回归方程

2.4.2 精密度 取对照品稀释混合液 5 μL，按“2.1”项进行测定。一天内连续进样6次，记录峰面积。结果没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖峰面积的RSD分别为0.36%、1.73%、0.39%、3.0%、1.59%，5种成分峰面积的RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性 取1份批号为Bs2015121506的样品制备供试品溶液，分别于第0、12、24、36和48 h按“2.1”项进行测定。结果没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖峰面积的RSD 分别为 2.98%、2.68%、2.37%、1.73%、2.41%，表明白芍供试品溶液中各成分在48 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性 取批号为Bs2015121506的样品6份，按“2.3”项制备供试品溶液，按“2.1”项测定。 结果没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖峰面积的RSD分别为2.76%、2.78%、2.05%、1.37%、1.93%，5种成分峰面积的RSD均小于3%，表明本方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率 取批号为Bs2015121506的样品、精密称取6份，分别加入样品含量50%的对照品溶液，按“2.3”项方法制备供试品溶液，“2.1”项测定，记录峰面积，计算平均加样回收率。结果没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖的平均加样回收率分别为100.37%、99.03%、101.22%、100.94%、101.79%，RSD 分 别为2.34%、2.53%、2.78%、1.21%、2.65%。

2.5 样品测定 2.3项下处理20批样品，“2.1”项下进行测定，采用外标法计算没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖的含量，结果见表3。

3 讨 论

3.1 检测波长的选择 混合对照品稀释液在190～400 nm的波长范围内检测，分别在250 nm和230 nm附近出现两个吸收峰，且在230 nm下各目标成分峰形、分离度较好，检出强度适中，故选择230 nm为检测波长。

3.2 流动相的选择 15版药典以乙腈与0.1%磷酸为流动相，但对色谱柱和仪器损伤较大，本实验考察不同浓度的甲酸对芍药苷拖尾因子的影响，可以改善芍药苷峰形。

3.3 提取溶剂的选择 考察不同浓度的甲醇、乙醇对目标成分提取效率的影响，结果选择75%甲醇作为提取溶剂时提取效率最高。

3.4 提取方法的选择 在提取方法的选择上采用高效液相色谱为检测手段，以提取效率为考察参数，将回流提取法和超声提取法进行比较。结果显示，在提取时间、提取试剂用量等方面，超声提取更有优势，提取时间短、提取效率高，是中药材有效成分提取的一种新兴方法。

综上所述，本研究建立HPLC法，同时测定白芍中没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖5种成分的含量，可以为白芍整体质量控制评价体系的建立提供实验依据。

表3 20批白芍样品5种成分含量%

序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20样品批号Bs2015121401 Bs2015121402 Bs2015121403 Bs2015121404 Bs2015121405 Bs2015121406 Bs2015121407 Bs2015121408 Bs2015121409 Bs2015121410 Bs2015121501 Bs2015121502 Bs2015121503 Bs2015121504 Bs2015121505 Bs2015121506 Bs2015121507 Bs2015121508 Bs2015121509 Bs2015121510没食子酸含量0.084 0.102 0.117 0.097 0.087 0.152 0.080 0.156 0.090 0.083 0.101 0.096 0.084 0.098 0.096 0.093 0.125 0.129 0.111 0.137氧化芍药苷含量0.016 0.022 0.000 0.025 0.016 0.000 0.010 0.000 0.025 0.023 0.020 0.022 0.016 0.019 0.027 0.026 0.017 0.018 0.021 0.023芍药内酯苷含量0.454 0.534 0.462 0.566 0.726 0.943 0.753 0.947 0.517 0.449 0.539 0.526 0.454 0.406 0.563 0.940 0.454 0.454 0.446 0.537芍药苷含量0.260 2.380 0.260 2.470 1.430 0.090 2.290 0.190 2.240 2.430 2.090 2.170 2.120 2.870 2.870 2.830 2.590 2.620 2.770 2.880 β-五没食子酰葡糖含量0.223 0.286 0.306 0.319 0.238 0.381 0.292 0.330 0.240 0.292 0.239 0.276 0.223 0.201 0.250 0.308 0.316 0.422 0.253 0.409