二氢杨梅素对活化的BV2小胶质细胞表型转化的影响

胡永红，魏艺聪，管江丽，余 意，桂孟玹，王瑞国

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

神经炎症由激活和增殖的小胶质细胞及星形胶质细胞等引发，生成促炎细胞因子、趋化因子等炎症介质，导致神经元损伤［1-2］。小胶质细胞（mi croglia，MG）是中枢神经系统（central nervous system，CNS）的组织驻留巨噬细胞，在神经发育、体内稳态和神经炎症中发挥着关键作用［3］。活化后的小胶质细胞根据表型不同，可分为M1型（促炎型）及M2 型（抗炎型）小胶质细胞［4］。 二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）具有加速抗氧化、止咳、抗肿瘤，保肝等多种药理作用［5-6］，由于毒性小，近年来抗炎作用也备受关注。因此本研究用体外炎症模型来探讨DMY对BV2细胞表型变化的影响，旨在进一步确认DMY作为新型神经保护剂的可能性及其潜在的神经保护机制，为后续疾病的研究和新药的开发提供实验参考。

1 实验材料

1.1 实验细胞 BV2细胞株通过上海复祥生物科技有限公司采购于美国ATCC公司。

1.2 实验药物与试剂 二氢杨梅素（源叶生物公司，批号：S06J6L1，纯度＞98%）；脂多糖（LPS，美国Sigma公司，批号：L2880）；RPMI 1640 培养基、胎牛血清（FBS）、磷酸盐缓冲液（美国 Gibco公司）；CD14抗体（美国CST公司）；iNOS抗体（美国 Santa cruz公司），Arg1抗体（美国abcam公司）。

1.3 实验仪器 倒置荧光显微镜（德国Leica公司）；Primor高速台式冷冻离心机（美国 Thermo Fisher公司）；酶标仪（TECAN 公司）；MiNiPROTEANTetra小型垂直电泳槽、MiNiTrans-Blot小型转印槽、ChemiDocXRS、凝胶成像分析系统（美国 Bio-Rad公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养 BV2细胞用完全培养基（含10%FBS、100 U／mL 青霉素、10 μg／mL 链霉素的 RPMI 1640培养基）进行培养，将其置于 37℃、5%CO2的培养箱中，每隔24 h换1次培养液，48 h传代1次。

2.2 DMY对细胞活性的影响 将DMY溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成 100 mmol／L 的储存液，－4℃储存。取对数生长期BV2细胞按1×104／孔的密度接种于96孔板中，使用完全培养基培养24 h后，在含1%FBS的RPMI 1640培养基中分别加 入 0、10、20、40、50、60、80、100 μmol／L DMY 以替换旧培养液。培养24 h后，每孔加入10 μL的MTT（5 mg／mL），继续培养 4 h 后，每孔加入 150 μL DMSO，震荡10 min至甲臜颗粒完全溶解，酶标仪490 nm波长处测定各孔OD值，并计算出各组细胞活力。

细胞活力／%＝实验组吸光值／对照组吸光值×100%。

2.3 细胞分组及干预 实验分为5组，即正常组、LPS 组 （100 ng／mL）、DMY 低 剂 量 组 （10 μmol／L DMY＋100 ng／mL LPS）、DMY 中剂量组（20 μmol／L DMY＋100 ng／mL LPS）、DMY 高剂量组（40 μmol／L DMY＋100 ng／mL LPS）。 BV2细胞用 DMY 干预半小时后，给予LPS进行造模，培养24 h后去掉上清液，收集细胞进行后续实验。

2.4 Western Blot检测 取对数生长期的BV2细胞，按照 3×105／孔的密度接种于6孔培养板中，使用完全培养基培养24 h后，按上述分组进行干预造模，培养24 h后，去掉上清液保留细胞沉淀，提取总蛋白，按照BCA蛋白定量试剂盒说明测定各组蛋白浓度后，加入蛋白上样缓冲液并调整上样量后，进行SDS-PAGE电泳转膜并封闭，按照不同分子量将 NC 膜分别加入稀释的 iNOS（1∶200）、CD14（1∶1 000）、Arg1（1∶1 000）抗体中，4 ℃摇床过夜。 孵育结束，TBST洗膜3次，每次10 min。洗膜结束后用二抗（1∶10 000）室温孵育 2 h，TBST 洗膜 3 次，每次10 min。使用 ECL化学发光显影定影。

2.5 统计学方法 数据处理均用SPSS 18.0统计软件，符合正态分布的数据用（）表示，非正态分布数据采用非参数检验方法（Nonparmetric tests）。多组间均数比较采用单因素方差分析，方差齐则采用LSD检验，方差不齐则用Games-Howell检验。

3 结 果

3.1 DMY对BV2细胞活力的影响 DMY浓度为60～100 μmol／L 时，DMY 明显降低 BV2 细胞活性（P＜0.01），见图 1。

图1 不同浓度DMY作用后BV2细胞活力的变化

3.2 DMY对BV2细胞蛋白表达的影响 见图2～3。

图2 5组BV2细胞CD14、iNOS、Arg1蛋白电泳图

图3 DMY对CD14、iNOS、Arg1蛋白表达影响

4 讨 论

小胶质细胞在神经炎症、神经修复和神经毒性中起着关键作用［7］。当小胶质细胞被炎症介质刺激激活时，它们可以通过吞噬作用或分泌各种炎症介质来修复神经元损伤；然而，当小胶质细胞不断被激活时，这些炎症介质可能是有害的［8］。可溶性脂多糖受体CD14是一种糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，是Toll样受体的辅受体，CD14激活后，Toll样受体可与病原体表面的特异性抗原结合，进一步激活核因子，引起炎症反应，在细菌、病毒、真菌等感染过程中具有重要作用［9］。本研究中二氢杨梅素能显著抑制LPS诱导的小胶质细胞中CD14的表达，表明CD14在炎症发生过程中起着重要的作用，且DMY具有抑制小胶质细胞激活的作用。

有研究认为，M1小胶质细胞的过度活化和M2小胶质细胞缺乏响应是神经炎症发生的重要机制，可通过诱导小胶质细胞从促炎性的M1型向抗炎性M2型的转化，以达到缓解CNS炎症，减轻神经元损伤的目的，是神经保护治疗的一种有效方法，但是目前关于小胶质细胞表型的研究相对较少［10-11］。本研究中，小胶质细胞活化后，经DMY干预治疗后，iNOS表达明显降低，而Arg1表达明显增加，且均具有剂量相关性，表明DMY可抑制活化小胶质细胞向M1型即促炎表型极化，并促进其向M2型即抗炎表型转化，以达到抑制神经炎症、保护神经元的作用。

综上所述，本研究发现DMY抑制活化的小胶质细胞向M1型即促炎表型极化，同时促进其向M2型即抗炎表型转化，有效抑制LPS引起的小胶质细胞活化。其结果将有助于对神经炎症的深入了解，为后续疾病的研究和新药的开发提供可靠的实验数据，也进一步确认了DMY作为新型神经保护剂的可能性及其潜在的神经保护机制。