基于差异蛋白组学的活血养血汤干预兔脊髓缺血再灌注损伤模型作用机制研究

刘 宇 ，张 燕 ，刘俊宁 ，林庆宾 ，陈 鹏

（1.福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中医骨伤及运动康复教育部重点实验室，福建 福州 350122）

脊髓缺血再灌注损伤（spinal cord ischemia reperfusion injury，SCII）多见于脊柱外科及胸腹部手术后的继发性神经功能损伤［1］、脊髓神经细胞损伤和神经功能障碍，甚至出现不可逆性神经损害。SCII是受多因素、多途径、多步骤参与调控的复杂性疾病。SCII中医病机为“血瘀”和“血虚”互为因果。活血养血汤是已故名老中医张安桢教授的经验方，具有活血化瘀、理气补血养血的功效。课题组前期研究表明活血养血汤对SCII有明确的临床疗效［2］。为进一步探讨活血养血汤治疗SCII的作用机制，我们应用兔SCII模型，采用蛋白组学技术筛选出活血养血汤干预兔SCII模型差异蛋白后，进行生物信息学分析，从蛋白质组学角度探讨活血养血汤改善SCII的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级4月龄新西兰大白兔12只，雌雄各半，体质量（2.5±0.2）kg，动物合格证号：SYXK（闽）2015-0001。委托福建中医药大学动物实验中心购买，全程在动物实验中心兔饲养室标准化饲养1周，期间适时观察动物生长情况。

1.2 实验药物 活血养血汤药物组成：黄芪9 g，当归 9 g，白芍 9 g，川芎 6 g，制首乌 9 g，续断 9 g，太极参 9 g，炙甘草 3 g，骨碎补 9 g，羌活 9 g，独活9 g。由福建中医药大学国医堂医院药剂科制备，加工成含生药量1 g／mL的药液，无菌保存备用。

1.3 实验试剂 TMT标记试剂盒（美国Thermo公司）；BCA试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；乙腈、超纯水（美国Fisher Chemical公司）；三乙基碳酸氢铵、二硫苏糖醇、碘代乙酰胺、三氟乙酸、尿素（美国Sigma公司）；甲酸（瑞士Fluka公司）；蛋白酶抑制剂（德国Calbiochem公司）；胰酶（美国Promega公司）。

1.4 实验仪器 Waters BreezeTM 2高效液相色谱仪（美国 Waters公司）；Scientific Q Exactive高分辨质谱仪（美国Thermo公司）。

2 实验方法

2.1 动物模型制备 参照 Kwun［3］的造模方法，水合氯醛腹腔注射麻醉。切口选取剑突下3 cm至耻骨联合上6 cm，腹部正中切口，皮肤、皮下组织逐层切开，暴露肠管并用无菌辅料保护，推向一侧，小心将腹主动脉下方分离出来，致动脉分叉水平，然后沿腹主动脉走形仔细分离出第3～6腰动脉，用Scoville-Lewis血管夹夹闭，无菌敷料覆盖，关闭腹腔，30 min后小心取出血管夹，恢复血液再灌注1 h，建立兔SCII动物模型，整个过程均在严格无菌操作下进行。

2.2 动物分组给药及取材 按随机数字表法分为模型组和药物组各6只，模型组灌胃生理盐水，药物组灌胃活血养血汤1周，余处理同常规饲养。家兔给药剂量参照对比人体表面积关系计算，药物组按2.45 g／（kg·d）给予活血养血汤灌胃，模型组予等量生理盐水灌胃，持续干预1周。1周后按上述造模方法建立动物模型，阻断第3～6腰动脉30 min后再灌注1 h后，兔背部正中切开，逐层分离，暴露腰段脊髓并分离，锐性无创截取腰段脊髓组织作为标本，迅速放置于－80℃保存。

2.3 提取蛋白 称取适量击碎组织标本，在液氮充分的研钵中研磨，加入4倍体积的含尿素和含1%蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液行超声裂解，4℃下12 000 r／min离心10 min，采用BCA试剂盒行蛋白浓度检测。

2.4 胰酶溶解标本 56℃条件下加入二硫苏糖醇，还原30 min后，添加碘代乙酰胺，使浓度从5 mmol／L 增至 11 mmol／L，室温下孵育 15 min 后，在37℃下加入胰酶过夜，胰酶与蛋白质量比为1∶50，再次加入胰酶，混合胰酶与蛋白质量比为1∶100后酶解4 h。

2.5 TMT标记及HPLC分级 用Strata X C18将胰酶溶解后的肽段除盐后冷冻，0.5 mmol／L TEAB溶解肽段，按照TMT试剂盒要求标记。

2.6 液相色谱-质谱联用分析 在液相色谱流动相 A相［0.1%（v／v）甲酸水溶液］条件下溶解肽段后，用EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离，将肽段注入NSI离子源中电离后行Q ExactiveTM Plus质谱分析，用数据依赖型扫描（DDA）程序进行数据采集。

2.7 数据库搜索 使用Maxquant（v1.5.2.8）行二级质谱数据检索，检索数据库为Uniprot Oryctolagus cuniculus，Trypsin／P方式酶切，最小肽段长度设为7个氨基酸残基，修饰最大值为5，漏切位点数为2，二级碎片离子质量误差为0.02 Da，一级母离子质量误差容忍度分别为20 ppm和5 ppm，可变修饰成为蛋白N端的乙酰化和甲硫氨酸的氧化，定量设置为TMT-10plex，PSM鉴定和蛋白鉴定的FDR均设置为1%。

2.8 生物信息学分析 对分析鉴定到及定量到的差异蛋白行生物信息学分析，对上述差异蛋白的特征和功能等进行基因本论（Gene Ontology，以下简称GO）注释、亚细胞结构定位、KEGG通路和蛋白结构域（domain）等功能注释类型的富集分析。

3 结 果

3.1 差异表达蛋白统计及描述 通过上述差异蛋白组学方法共筛选出48个差异蛋白，以变化阈值＞1.2倍作为差异标准，上调蛋白（＞1.2）26个，下调蛋白（＜0.83）22个。上调蛋白包括：Fucose mutarotase、Tryptophan-tRNA ligase，cytoplasmic、Sorcin、Argininosuccinate synthase、Coiled-coil domain-containing protein 28A、RELT-like protein 1、Serpin B6、E3 ubiquitin-protein ligase parkin、Exosome complex component RRP43、Microtubule-associated proteins 1A ／1B light chain 3B、Short／branched chain specific acyl-CoA dehydrogenase，mitochondrial、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Syntaxin-binding protein、Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M、2'，3'-cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase、Calcyphosin、Wiskott-Aldrich syndrome protein family member 1、Retinal dehydrogenase 1、ATP-binding cassette sub-family F member 1、Sec1 family domaincontaining protein 2、Multivesicular body subunit 12B、Peroxi-somal bifunctional enzyme、UPF 0160 protein MYG1，mitochondrial、Ribosomal protein S6 kinase delta-1、Zinc finger and BTB domain-containing protein 47、Hematopoietic lineage cell-specific protein。下调蛋白包括：Vacuolar protein sorting-associated protein 8 homolog、Protein FAM210B、Serine／threonine-protein phosphatase 6 regulatory subunit 3、A-cyl-CoA dehydrogenase family member 9，mitochondrial、Phenazine biosynthesis-like domain-containing protein、Calcium／calmodulin-dependent protein kinase kinase 1、Acyl-coenzyme A thioesterase 1、NADPH：adrenodoxin oxidoreductase，mitochondrial、Protrudin、Acyl-coenzyme A thioesterase THEM4、Glutathione S-transferase Yb、Triokinase／FMN cyclase、THUMP domain-containing protein 1、Isochorismatase domaincontaining protein 1、D-2-hydroxyglutarate dehydrogenase，mitochondrial、Complement decay-accelerating factor、Laminin subunit beta-1、Serpin B9、Basal cell adhesion molecule、Apolipoprotein A-I、Sushi domaincontaining protein 2、Ketimine reductase mu-crystallin。

3.2 2组差异蛋白在GO二级注释中的分布情况见表1。

3.3 2组差异蛋白的亚细胞结构定位分布情况见表2。

3.4 KEGG通路富集 富集分析得到的KEGG通路主要在脂肪酸生物合成方面，其中上调蛋白体现通 路 有 Hexa-decanoyl-Coa、Tetra-decanoyl-Coa、Dodecanoyl-Coa、Decanoyl-Coa、Octanoyl-Coa， 上调和下调蛋白共同体现的通路有Hexanoyl-Coa、Butanoyl-Coa。 见图 1。

3.5 蛋白结构域富集 见图2。

4 讨 论

活血养血汤是活血养血法代表方剂，乃我国已故著名骨伤科大师张安桢教授跟随福建骨伤科名医林如高老先生多年，总结其临床经验，在林老先生经验方理气补血汤基础上化裁而来。前期研究表明，理气补血汤可促进神经修复再生，提高神经功能恢复，临床多用于神经损伤疾病的治疗［2］。SCII作为中枢神经损伤疾病，损伤造成的主要因素非缺血本身，而是缺血一段时间以后又突然恢复供血，从而造成的二次损伤。中医辨证属“血瘀”和“血虚”。“血瘀”“血虚”互为因果，“血瘀”导致气血不通，气血无法接续，从而加重“血虚”，而“血虚”必然导致气血两虚，气虚无力推动血行，血液运行不畅，加重“血瘀”，恶性循环，逐渐加重疾病发展。活血养血汤中当归、白芍、川芎为君药，当归活血化瘀，白芍养血柔肝敛阴，川芎行气活血，三者共同达到活血行气的作用；臣药为黄芪、制首乌、太极参、续断、骨碎补，黄芪、太极参、制首乌补气养血，续断、骨碎补补肝肾、壮筋骨；羌活、独活为佐药，舒筋活络；炙甘草为使药，调和诸药。以上诸药配伍，以达到活血养血、补肝肾壮筋骨的目的。

表1 2组差异蛋白在GO二级注释中的分布情况

表2 2组差异蛋白的亚细胞结构定位分布情况

蛋白质组一词是由澳大利亚学者MarcWilkins于1994年最先提出，是指基因表达的全部蛋白质，或细胞组织机体在特定时间和空间表达的所有蛋白质。蛋白质组学的建立为在蛋白质水平上研究生命活动和人类疾病提供了崭新的技术手段，将对细胞功能展开更深入的研究［4-6］。本实验通过将TMT标记、高效液相色谱分级技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术等一系列前沿技术进行有机结合，对活血养血汤干预兔SCII模型脊髓组织进行定量蛋白组的研究，然后筛选差异表达蛋白进行GO注释、亚细胞结构定位、KEGG通路和蛋白结构域等相关联蛋白的生物信息学分析。

GO对蛋白质组学层面的注释来源于UniProt-GOA 数据库（http： ／／www.ebi.ac.uk／GOA ／）。 使用预测亚细胞定位的软件wolfpsort对所提交的蛋白进行亚细胞定位注释［5，7-8］，使用 KEGG 通路数据库对蛋白通路进行注释：首先，使用KEGG在线服务工具KAAS对提交的蛋白进行注释，之后通过KEGG mapper将注释过的蛋白匹配入数据库中相应的通路中。使用基于蛋白序列算法的软件InterProScan以及相应的InterPro结构域数据库对鉴定到的蛋白质进行蛋白结构域注释。GO即基因本论，是一个重要的生物信息学分析方法和工具，用于表述基因和基因产物的各种属性。GO注释分为3个一级大类：生物进程、细胞组成和分子功能，从不同角度阐释蛋白的生物学作用。我们对定量到的蛋白质在GO二级注释中的分布进行统计。蛋白质结构域是指在不同蛋白质分子中重复出现的某些组分，具有相似的序列、结构和功能，是蛋白质进化的单元，结构域的长度通常在25个氨基酸和500个氨基酸长度之间。KEGG是连接已知分子间相互作用的信息网络，如代谢通路、复合物、生化反应，KEGG途径主要包括：代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、人类疾病、药物开发等，富集分析得到的KEGG通路可以网页形式进行可视化展示。

图1 2组差异表达蛋白显著富集的某KEGG通路可视化展示图

图2 上调蛋白（A）和下调蛋白（B）的蛋白结构域富集图

实验结果表明，2组比较差异表达蛋白中上调26个，下调22个。GO注释分类统计结果表明，上调和下调蛋白均在生物进程中单一生物过程、代谢过程和生物调节上表达明显；上、下调蛋白在细胞组成方面主要集中在细胞器和细胞膜中；在分子功能方面上以粘附和催化活性表达为主。亚细胞结构定位结果表明上、下调蛋白均在细胞质上有最多体现。KEGG通路上调蛋白主要体现在上皮细胞的细菌侵袭，下调蛋白主要体现在阿米巴病元通路上。蛋白质结构域上调蛋白集中体现在Rossmann-like alpha／beta／alpha sandwich fold， 而下调蛋白体现在硫酯酶结构域等8个方面。

活血养血汤为名老中医经验方，该方对于脊髓神经损伤有较好的临床疗效［2］。本实验从蛋白组学角度出发，研究活血养血汤干预兔SCII模型差异蛋白的表达，并对筛选出的差异蛋白进行系统的生物信息学分析，进一步阐明其作用靶点，为后续研究及临床应用提供理论依据。