Nafamostat修复脊髓损伤的研究进展

高仕杰，石家晓，李波

天津医科大学总医院骨科 (天津 300052)

脊髓损伤是一种严重的、致残率较高的疾病。目前针对脊髓损伤的修复研究面临许多困难，如神经元的凋亡、机械屏障的生成、神经营养因子的缺失、抑制轴突再生的因素等。不同学者尝试用不同方法克服以上困难。本研究就修复药物Nafamostat修复脊髓损伤的效果进行综述。

1 脊髓损伤后的微环境改变

脊髓损伤宏观上是指外伤或者退行性病变等原因导致的脊髓压迫及受损，为脊髓损伤的第一阶段。在此基础上，进一步引起链式反应，即第二阶段，各种分子病理机制陆续产生，如离子稳态的失调、局部水肿、缺血、局部出血、氧化应激及细胞凋亡，在脊髓损伤的恶化过程中，它们起着重要的作用，为此引出了一个新的定义：脊髓损伤微环境。

脊髓损伤微环境受脊髓及脊髓周围的各种细胞和相关因子同时影响。胶质瘢痕，是继发性脊髓损伤后的标志，可将损伤中心与正常的脊髓组织分离开来。胶质瘢痕由反应性星形胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞、小胶质细胞、巨噬细胞内皮细胞、成纤维细胞，以及这些细胞的细胞外基质混合而成。反应性星形胶质细胞，是脊髓损伤后胶质瘢痕的标志性细胞。目前反应性星形胶质细胞的启动、维持和迁移的机制已经逐渐被发现。在许多细胞外因子中，转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素-1(IL-1)和干扰素-γ(IFN-γ)已经被证明可以触发星形胶质细胞重新激活，mTOR-STAT3信号通路和BMP-mir-21轴也同样被证明对于反应性星形胶质细胞的基因表达谱至关重要。干扰这些信号传导中的任何一个都可以显著减少脊髓损伤后胶质瘢痕的形成。反应性星形胶质细胞在脊髓损伤中是一把双刃剑，在脊髓损伤早期，胶质瘢痕的形成起到一定的优势作用，其可以将炎症介质局限在一定的范围内，限制病灶的扩张，减少正常组织的受损，促进血管生成和血脑屏障的再建，为神经元提供营养支持。然而在损伤过程中后期，胶质瘢痕则成为神经元轴突途径中的重大阻碍。基于这一病理机制，脊髓损伤中后期抑制瘢痕形成，可以促进脊髓修复。

2 Nafamostat的作用机制

Nafamostat，别名Nafamostat Mesylate，分子式C19H17N5O2·2CH4O3S，是一种合成的蛋白酶抑制药，上市于日本，广泛地用于胰腺炎和弥散性血管内凝血患者的治疗[1]，还可作为血液透析的抗凝血剂。其临床应用取决于其对各种类型的丝氨酸蛋白酶(包括凝血酶因子Ⅸ,Ⅹ,Ⅻa,and Ⅶa)的活性抑制作用[2]。

目前，对Nafamostat的研究很多，从临床应用到实验研究，人们不断挖掘Nafamostat在疾病治疗中的潜力，并且进一步探寻其在疾病发展至治愈阶段的作用机制。目前的基础实验研究表明，在脓毒性休克、心脏缺血再灌注损伤、移植物排斥反应和急性炎性疾病等多种病理条件下，一氧化氮(NO)或过氧亚硝酸盐的产生与组织损伤有关[3]。在病理机制中NO参与了多种细胞类型的基质金属蛋白酶(MMPs)的激活，包括人软骨细胞、大鼠系膜细胞、人中性粒细胞和人血小板。MMPs的上调则可导致细胞外基质降解、炎性细胞外渗、血管生成和血小板聚集。Nafamostat可以明显抑制NO的合成、炎症反应的产生和细胞的凋亡[4]。这是由于Nafamostat的分子结构中具有胍基，这一结构特性使得Nafamostat可以竞争性抑制NO合成酶或者破坏其活性，从而影响NO的合成。同时，它还可以抑制由脂多糖(LPS)诱导的转录因子核因子-κB(NF-κB)，从旁路抑制NO合成酶的产生[5]。此外，Nafamostat还可以减少由LPS诱导的白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)[6]。众所周知，IL-8是激活多形核白细胞、增加血管通透性和诱导炎性新生血管的有力因子之一，IL-6是引起传染病中血小板增多的因子。Nafamostat还可以抑制炎症反应和微循环中血栓的形成。

Nafamostat在脑组织损伤修复方面也有相应的研究。有报道表明，血脑屏障(BBB)的破坏将导致脑水肿和出血，是脑卒中发病的重要因素[7]。现在越来越多的人支持这一理论，因此脑缺血后BBB损伤的减轻被认为可对神经进行保护。据报道，缺血性脑卒中后，在损伤的脉管系统，特别是缺血组织周围血管处凝血酶水平增加，进一步激活内皮细胞凝血酶受体1(PAR1)而诱导内皮功能障碍[8]，调高蛋白激酶Ca(PKCa)的活性[9]，还可以使内皮RhoA活化[10]，这3点共同导致BBB完整性的破坏，意味着局部缺血和凝血酶是损伤血脑屏障的重要原因[11]。BBB由众多的细胞和结构组成，包括内皮细胞、基底膜、星形胶质细胞和周围细胞，是由相邻内皮细胞的紧密连接及相关蛋白联合作用形成，特别是紧密连接蛋白闭合蛋白和闭锁小带蛋白1(ZO-1)，其表达水平的高低直接影响内皮屏障的通透性[12]。PKC是一种家族蛋白，主要通过磷酸化蛋白的丝氨酸和苏氨酸氨基酸残基的羟基，参与控制该蛋白的功能，进而调节细胞内信号传导，PKC家族中PKCa在内皮细胞渗透性的调整上起着一定的作用。RhoA，参与多种细胞程序，包括内皮细胞屏障的完整性和功能的调节[13]。大量数据表明，凝血酶可以促进RhoA连接其下游作用因子Rho-激酶，进而导致肌球蛋白轻链(MLC2)磷酸化和肌动蛋白纤维的形成，从而使BBB的渗透性随之提高[14]。此外，RhoA的激活已被证明与紧密连接蛋白状态有关[15]。为了证明Nafamostat对脑组织修复的有效性，采用动物体内及体外实验进行验证，经过Nafamostat处理过的大鼠，闭合蛋白和ZO-1的表达水平得到了提高，PKCa磷酸化的水平未见明显增长，并减缓了Rho活性的增加，以及MLC2磷酸化和肌动蛋白纤维的形成。表明Nafamostat可通过抑制凝血酶减轻BBB的损害，进一步证明了Nafamostat可通过PKCa/RhoA/p-MLC2发挥作用，保护BBB完整性[16]。

随着精准医学的发展，人们的研究领域也在不断拓宽，对于脑损伤后神经的修复，不再局限于凝血酶、炎症介质，而是从细胞整体功能的研究，逐渐拓展到细胞器功能的探索。已有研究表明，内质网应激是促进凋亡信号和感知脑损伤的关键成分，在缺血诱导的神经元变性中起关键作用[17]。例如，缺血/再灌注损伤可诱导神经元在缺血区的凋亡和上调内质网应激标志物的表达，包括葡萄糖调节蛋白(GRP78)和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)[18]。GRP78作为一个良性标志物，可以减少对CHOP的诱导、细胞的凋亡并阻止内质网的应激[19]。在短暂大脑中动脉闭塞(MCAO)的实验中，Nafamostat抑制了CHOP的表达，还可通过抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化增强神经细胞中GRP78的表达[20]。文献[21]报道，CHOP的诱导主要通过未折叠的蛋白反应调控PERK-eIF2α-ATF4信号通路进行，我们检测出在MCAO组中eIF2α表达上调，应用药物治疗后eIF2α表达受抑制，进一步证明了Nafamostat主要是抑制eIF2α来调控CHOP[20]。

以上实验均证实了Nafamostat是一种很有潜力的药物，可以治疗缺血性脑卒中及修复神经元的损伤。

3 Nafamostat在脊髓损伤修复中的应用

有报道证明Nafamostat可增加同侧海马、对侧和同侧感觉运动皮层脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)和神经营养因子3(NT3)的表达，激活TrkB/ERK1/2-CREB信号通路，抑制同侧海马和对侧感觉运动皮质的Cdk 5活性，但不影响JNK和p38 MAPK的磷酸化。通过这些通路传导及各类因子的释放，对侧皮质红核束和皮质脊髓束中的纤维数目得以增加，同样延长了皮质脊髓束纤维的总长度，同时增加了对侧感觉运动皮质生长相关蛋白43(GAP-43)蛋白水平的表达。这些结果提示，Nafamostat能促进损伤对侧皮质轴突再生，并支配同侧红核和脊髓运动神经元，同时也证明了Nafamostat在中枢神经疾病修复中可以起到一定的作用[22]。脊髓作为中枢神经中脑的延伸部分，拥有中枢神经的特性。脊髓损伤同样也是中枢神经的损伤，脊髓的修复也就等同于轴突的再生及突触的重塑，我们可根据Nafamostat在脑损伤中的应用，并根据其药理机制和适应证，探寻脊髓损伤后的病理因素和微环境是否可以被Nafamostat抑制或者改善，从而使得脊髓损伤的患者得到功能康复。最近的实验表明，Nafamostat能够显著促进脊髓损伤后大鼠的运动功能恢复，显著增加灰质与白质组织，还能够降低肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与IL-6的表达，抑制脊髓损伤处凝血酶的表达，提高神经营养因子(NT-3、BDNF、NGF)的表达，起到调节脊髓损伤处微环境、改善功能与组织恢复的效果[23]。