克里米亚-刚果出血热病毒反向遗传学系统的开发及应用

任南洁，赵路，袁志明，夏菡

中国科学院 武汉病毒研究所，湖北 武汉430071

CCHFV的基因组结构和其他布尼亚病毒类似，由3节段负链RNA组成，分别是小片段（S）、中片段（M）、大片段（L），它们分别编码病毒的核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，NP）、糖蛋白前体（glycoprotein precursor，GPC）和病毒RNA 依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）[5]。每个基因组片段中都包含1个开放读框（open reading frame，ORF），ORF的两端为非翻译区（untranslated region，UTR）。其中，L片段的基因组最大（～12 kb），远大于布尼亚病毒目中其他病毒的L片段，其编码的RdRp 由4000 多个氨基酸残基组成，相对分子质量约为450×103。除RdRp的活性外，L片段编码的蛋白还含有1个OTU（ovarian tumor，卵巢肿瘤）结构域，可能与病毒逃逸宿主的先天免疫有关。M片段约为5.4 kb，其转录翻译首先合成糖蛋白前体，然后在宿主来源的多种蛋白酶的作用下，剪切加工为病毒包膜上的糖蛋白GN和GC，以及非结构蛋白mucin、GP38、NSM的前体[6]。GN和GC含有中和抗原决定簇，在病毒吸附和侵入宿主细胞的过程中起重要作用，能诱导中和抗体产生[7]，而具有这种免疫原性的M片段的快速突变和频繁重排已有报道[8]。S片段大小为1.6 kb，编码NP 蛋白和1个非结构蛋白（nonstructural proteins，NSs），NP 蛋白可以将病毒RNA和cDNA 包装为核糖核蛋白颗粒（ribo⁃nucleoprotein particles，RNPs），并与病毒mRNA的5'UTR 以高亲和力结合，然后促进mRNA 翻译[9]。

CCHFV基因组的S、M和L片段ORF 两端的UTRs 足以用于病毒小基因组RNA的转录、复制和包装[10]。UTRs 由可变区和高度保守的末端区域组成，末端保守的核苷酸能互补形成非共价闭合的二级结构，与病毒聚合酶进行相互作用。

反向遗传学技术是以生物基因为主要研究对象，基于对基因核苷酸序列的人为操作，探索基因调控的分子机制以及生命发生发展的本质现象和规律等[11]。反向遗传学系统可使我们设计病毒个别基因的特定突变，从而研究各个基因在病毒复制、转录、装配和致病方面的具体功能。目前对于CCHFV 还有很多问题待厘清，CCHFV的反向遗传学系统能极大地便于研究该病毒的复制循环、包装释放、宿主免疫入侵、病毒与宿主的相互作用机制等问题。RNA病毒的反向遗传学系统需要在cDNA 水平上操作基因，将其转染细胞后，拯救出具有感染性的活的子代病毒（野生型或突变型）[12]。但是，负链RNA病毒的基因组RNA在宿主细胞体内不能启动感染循环，只有病毒的基因组RNA与NP、磷酸化蛋白以及RdRp共同形成功能性的RNP 之后，才具有感染性，因此负链RNA病毒反向遗传学系统的建立十分复杂困难[11]。而CCHFV 由于其编码RdRp的L片段远大于其他布尼亚病毒，故其反向遗传学系统的构建难度极大，自2003年成功构建CCHFV 小基因组系统开始，经过10 多年的发展，直到2015年才构建出CCHFV的全病毒拯救系统。

本文综述了CCHFV 反向遗传学的研发历史及现状，并简介了CCHFV 反向遗传系统在病毒功能基因、药物筛选和疫苗研制中的应用。

1 CCHFV 反向遗传系统研究进展

1.1 CCHFV 小基因组系统的建立

2003年，Flick等建立了CCHFV的小基因组（minigenome）系统。他们利用人和鼠的RNA 聚合酶Ⅰ（polⅠ）的启动子构建了带有人工病毒RNA基因组片段的转录质粒，基因组片段又包含了病毒RNA 或其互补正义链、报告基因[绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）、氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltransferase，CAT）]，以及病毒S片段的非编码区（non-coding regions，NCRs）。将该质粒转染不同的真核细胞后，可在细胞中观察到报告基因的表达，并且在病毒传代后，报告基因依然表达，证实了polⅠ系统可驱动小基因组的包壳、转录和复制，并且可将小基因组包装为具有感染能力的子代病毒（图1A）。该系统首次证明了polⅠ系统可用于布尼亚病毒的反向遗传学系统建立，并且提供了研究CCHFV 生物学功能和预防治疗措施的新途径[13]。但是，由于这一系统依赖于CCHFV 辅助病毒，导致它的应用依旧局限于高等级生物安全实验室中，并且无法对病毒的L片段和S片段进行更深入的研究。

2010年，Bergeron 等构建了一个不依赖于CCHFV 辅助病毒的高效反向遗传学系统。他们构建了带有T7 启动子的S、L片段ORFs的表达质粒，和带有GFP 或Gaussia 萤光素酶（Gluc）报告基因的小基因组，转入可稳定表达T7 RNA 聚合酶的BSR-T7细胞，得到了具有复制能力，但不具有感染能力的病毒RNA（图1B）[10]。这是正内罗病毒家族成员中第一个不依赖于辅助病毒的小基因拯救系统，虽然该系统依然未能成功获得具有感染能力的病毒，但是可以对CCHFV的L和S片段以及RNA 模板进行基因修饰，进而研究病毒的转录、复制和包装机制。

2013年，赵九如等建立了一套不依赖辅助病毒，基于增强绿色荧光蛋白（enhanced GFP，EGFP）报告基因的CCHFV 小基因组拯救系统。他们将带有S、L片段ORFs的辅助质粒，和带有S/M/L片段的UTRs 以及报告基因EGFP的小基因组共转染细胞，之后在荧光显微镜下观察到了绿色荧光，证明该小基因组拯救成功（图1B）[14]。

1.2 进入和转录能力的病毒样颗粒（transcriptionand entry-competent virus-like particle，tecVLP）

2015年，Bergeron 尝试了CCHFV tecVLP系统的建立。病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）在形态学上与病毒相似，具有转录和进入细胞的能力，但是不能表达病毒蛋白，所以只能模拟病毒单周期感染，无法产生感染性病毒，故可以在BSL-2 实验室中进行研究。VLP 应用广泛，可用于抗病毒药物筛选，检测单克隆抗体效力，确定病毒重组的潜在分子决定因素，制作疫苗等。

1.2 诊断标准 两组患者均符合《中华外科杂志》编委会、中华医学会外科分会肛肠外科学组2000年制定的《痔诊治暂行标准》。

图1 CCHFV小基因组系统

Bergeron 对传统VLP 进行了改进，将CCHFV的NP 蛋白序列、密码子优化过的GPC 序列以及L蛋白序列分别连接在表达载体上，再加带有噬菌体T7 聚合酶的表达载体，和带有NanoLuc 萤光素酶（nanoluciferase）的小复制子，共5个质粒，共转染哺乳动物细胞，最终拯救出tecVLPs，并证明生成的tecVLPs与野生型CCHFV的形态一致，大小相对均匀（94±3 nm），可有效中和CCHFV 特异性单克隆抗体与药物，并且证实了生成的tecVLPs能且只能感染细胞1 次（图1C）[5]。这一tecVLP系统是一种安全、可靠、有效的分子研究方法，有助于在BSL-2 实验室中开展CCHFV 高通量药物筛选、抗体评估、感染分子机制等方面研究。

1.3 CCHFV 全病毒拯救系统的建立

在最初CCHFV 小基因组的拯救中，使用了辅助病毒进行共感染或双重感染，但是由于携带工程化基因组的病毒颗粒很难从辅助病毒中分离出来，因此建立反向遗传学系统的最终目的是创建仅含质粒或RNA、无需辅助病毒的反向遗传学系统[12]。但由于CCHFV的L片段过大，转染表达效率低，难以拯救，其全病毒拯救系统于2015年才陆续建立。

Bergeron 等首先于2015年尝试了利用T7系统的小基因组来拯救野生型CCHFV，但发现仅将带有T7 启动子的S、M、L片段的质粒共转染细胞并不能拯救病毒，原因可能是过长的L片段降低了重组RNPs的效率，或是L片段的mRNA在细胞核中发生异常剪接或提前终止。所以他们将L片段进行了密码子优化来替代野生型，转染细胞后检测到了L片段复制的荧光信号，随后通过调整各质粒比例，获得了具有感染性的重组CCHFV（图2 右）。这一技术将有助于研究CCHFV的复制周期、发病机制和传播[15]。

2017年，Stephen 等在Bergeron的基础上，将S片段替换为ZsGreen1（ZsG）荧光蛋白基因，拯救出带有报告基因的重组病毒（图2 左上），可用于药物筛选[16]。

2018年，夏菡等将NanoLuc基因与CCHFV M片段上的mucin 编码框融合，拯救出可分泌表达NanoLuc 萤光素酶的重组病毒（图2 左下）[17]。Na⁃noLuc 萤光素酶是目前性能最好的生物发光报告基因之一，其亮度比萤火虫萤光素酶（luciferase）高240倍，而大小仅为GFP的三分之二，可以最大限度地减少外源基因对病毒的干扰[18]。

图2 CCHFV全病毒拯救系统

2 CCHFV 反向遗传系统的应用

2.1 用于病毒基因功能的研究

CCHFV 异常巨大的L片段编码的L 蛋白组成复杂，研究发现其N端存在一些非经典L 蛋白功能的结构域，是在其他布尼亚病毒的基因组中未发现的。L 蛋白的第1～169 位氨基酸残基已被证明足以去除泛素（Ub）和类泛素蛋白[10]，在正链和负链RNA病毒的研究中，都曾发现具有相似活性的病毒OTU 域，其表达的去泛素化酶可以水解病毒的多聚蛋白，是某些病毒复制所必需的。而Bergeron 等通过突变L 蛋白OTU 域的活性位点，构建了L-OTU 蛋白酶失活的变体小基因组，将其转染细胞后并未发现突变体与野生型之间的差别，说明病毒RdRp的活性不受OTU 蛋白酶活性的影响，OTU 蛋白酶的活性对病毒RNA的复制并不是必需的[19]。

2013年，赵九如等利用建立的重组CCHFV 拯救系统，发现L、M、S 两端的UTRs在小基因组的表达中是必不可少的，并且L、M、S片段的UTRs活性水平呈逐渐降低的趋势。经系统分析，LUTRs 可以耐受某些核苷酸的突变，M-UTRs与其ORFs 具有相似的进化树结构，S片段的5'UTRs与ORFs的进化树几乎相同，而3'UTRs 则形成了新的分化群。这一系统为研究CCHFV 复制周期、致病机制和进化模式提供了基础[14]。

2.2 用于抗病毒药物的筛选和鉴定

因为CCHFV 属于第一类病原微生物，缺乏可用于生物安全二级实验室的高通量药物筛选系统，极大地限制了对其药物的研发和评估，而CCHFV 小基因组系统的建立正好解决了这一问题。

2010年，Bergeron利用他们构建的基于T7启动子系统的CCHFV 小基因组系统，发现利巴韦林可以通过抑制细胞RNA 聚合酶的活性，来抑制小基因组报告基因蛋白的合成，从而抑制CCHFV的小基因组的复制，证明利巴韦林对CCHFV的作用是特异性的，也说明该系统可以用于抗病毒药物的筛选[10]。这种方法相对于使用活的CCHFV的主要优点之一是不需要在高等级生物安全实验室中进行试验，极大地促进了CCHFV 抗病毒药物筛选的发展。但是，关于利巴韦林的效果在随后的研究中也有较大争议，有研究表明利巴韦林在感染早期使用有临床效果[20]，但也有分析提示利巴韦林的疗效较差且不稳定[21-23]。

2017年，Stephen 等利用构建的含报告基因的CCHFV/ZsG，建立了一种高通量筛选CCHFV 抗病毒药物的方法。该方法通过检测受感染细胞的荧光减少量来量化抗病毒化合物的病毒抑制效果。之后，他们发现2'-脱氧-2'-氟胞苷的抗病毒效果是利巴韦林的200倍，且与法匹拉韦（favipi⁃ravir）有协同作用，可以抑制CCHFV的复制而不引起细胞毒性[16]。这一发现不仅建立了利用报告病毒来高通量筛选抗病毒药物的方法，可以更快速地确定有效治疗方案，而且也可以用于CCHFV生命周期的研究。

2018年，夏菡等利用拯救出的可分泌表达NanoLuc 萤光素酶的重组病毒，对比了弗林蛋白酶抑制剂与利巴韦林的抗病毒效果，发现弗林蛋白酶抑制剂的效果差于利巴韦林，不适合作为CCHFV的抗病毒候选药物继续进行深入评估，但也证实该系统可用于抗病毒药物的体外快速初筛，为抗CCHFV 药物研发提供了技术支持[17]。

后2种系统均使用了带有报告基因的重组病毒，仍然需要在高等级生物安全实验室中操作，所以这也制约了其使用范围。

2.3 用于疫苗候选株的研究

目前，CCHFV 还没有获准使用的有效的预防疫苗，其惟一的疫苗是一种灭活病毒制剂，但由于其安全性问题，仅在保加利亚投入使用，并未在其他高危人群国家中获准使用[24-25]。

由于M片段编码的GPC 蛋白已被证明其产生的免疫反应对小鼠有重要的保护作用[26]，所以疫苗研发大多围绕GPC 蛋白展开。2017年，Aura等构建了编码M片段糖蛋白前体基因的DNA 疫苗结构，并对其在哺乳动物细胞中的表达进行了优化。随后，他们利用之前构建的CCHFV的VLP比较和量化了优化后的DNA 疫苗在2个具有相同遗传背景的小鼠模型实验中的体液反应和保护效果，发现密码子优化过的M片段DNA 疫苗具有较高的免疫原性，且可以在2种小鼠模型中都产生CCHFV 特异性的免疫反应及中和性抗体。虽然具体保护机制尚不清楚，且该疫苗是否能对基因距离较远的CCHFV 毒株提供交叉保护性免疫仍有待观察，但该研究为进一步了解CCHFV DNA 疫苗的保护能力提供了依据，并将有助于开发更加有效的CCHFV 疫苗[27]。

3 结语

反向遗传学作为一门新兴的分子生物学研究方法和技术，极大地推动了病毒学研究的发展，以往经典遗传学无法解决的问题，借助反向遗传学这一技术平台都可以被较好地揭示[28]。而CCHFV 作为第一类病原微生物，其反向遗传学的研究受实验条件的限制而发展缓慢，历经10 余年才终于完成全病毒的拯救。该系统不仅为CCH⁃FV 分子生物领域的研究提供了良好的工具，便于开展基因功能以及病毒致病机制等方面的研究，而且在抗病毒药物筛选和新型疫苗开发等实际应用方面都具有极大的价值。但是，目前关于CCHFV 反向遗传学仍有许多问题，如某些病毒蛋白的重要功能、病毒毒力的决定性遗传因素、病毒基因组UTR 区域对病毒复制转录的影响机制、合理且可用于临床的疫苗，以及疫苗实验动物模型的建立等，这些问题仍需要进一步探讨来给予合理解释。