circCMTM3通过海绵miR-588调控细胞迁移和侵袭

张增亮，张迎龙，李南

解放军总医院 第四医学中心骨科，北京100048

骨肉瘤是一种恶性肿瘤，最常见于儿童和青少年四肢长骨干骺端[1]。即使通过手术和新辅助化疗，治疗效果也只达60%～70%的生存率[2-4]，其中有转移和化疗耐药的患者存活率很低[5]。因此，需要新的生物靶点或分子机制来提高骨肉瘤治疗的疗效。环状RNA（circRNAs）具有保守性、稳定性、差异性及丰富性等特征，是在临床和医学研究中得到广泛认可的一种有用的生物标志物。circRNAs 可以充当miRNA海绵，是一种竞争miRNA和长链非编码RNA的新型内源性RNA。随着新一代测序和生物信息学分析的应用，更多的研究发现circRNAs 参与多种疾病进展，尤其是肿瘤的发生。研究报道，通过沉默circCMTM3（hsa_circ_0008450）可以调控miR-214-3p/EZH2 轴来抑制肝癌的进展[6]；circCMTM3 还可以通过靶向miR-577 上调CXCL9的表达，促进鼻咽癌细胞的增殖和侵袭[7]。本研究旨在探究circCMTM3在骨肉瘤细胞中的表达情况以及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

成骨细胞hFOB1.19，骨肉瘤细胞Huo9、G-292和Saos2 来自美国ATCC；pmirGLO 质粒购自上海柯雷生物科技有限公司；pLCDH-ciR 载体购自广州吉赛生物科技有限公司；10%胎牛血清和DMEM 培养基购自Sigma 公司；miR-588 mimics 或siRNA 来自广州市锐博生物科技有限公司；Lipo⁃fectAMINE 2000 转染试剂、TRIzol 试剂盒购自In⁃vitrogen 公司；CCK-8 试剂购自GlpBio 公司；双萤光素酶报告试剂盒购自Promega 公司；Transwell 小室和Matrigel 基质凝胶购自BD 公司；反转录试剂盒、SYBR green PCR mix、96 孔板、流式细胞分析试剂盒购自Thermo Fisher Scientific 公司；HRP 试剂、RIPA 缓冲液和PMSF 购自Solarbio 公司；PVDF膜购自Millipore 公司；流式细胞仪购自美国贝克曼公司。

1.2 细胞培养与转染

细胞用含10%胎牛血清的DMEM 培养基，于5% CO2、37℃恒温培养箱中培养。将circCMTM3的497 bp 序列长度构建至pLCDH-ciR 载体中，以空载体为对照，将载体分别转染骨肉瘤细胞，利用嘌呤霉素筛选细胞。通过LipofectAMINE 2000将miR-588 mimics 或siRNA 转染骨肉瘤细胞。

1.3 RNA 提取和qRT-PCR

TRIzol 法提取细胞总RNA，并利用反转录试剂盒合成cDNA，采用SYBR green PCR mix 进行qRT-PCR。U6和肌动蛋白（actin）分别为miRNA和mRNA的内参。引物见表1。

1.4 细胞增殖实验

将转染后的细胞以1.5×103/孔加入96 孔板，分别37℃恒温培养24、48、72和96 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL的CCK-8 溶液，继续37℃恒温培养4 h，酶标仪测定D450nm值。以时间为横坐标、D450nm值为纵坐标制作增殖曲线。

1.5 细胞迁移和侵袭实验

1.5.1 Transwell 迁移实验 将直径6.5 mm、孔径8 μm的Transwell 小室放入24 孔板中，上室加入200 μL 浓度为2×103/mL的无血清单细胞悬液，下室加入500 μL 含20%血清的培养基为迁移趋化物，于5% CO2、37℃恒温培养箱中培养24 h，取出小室，PBS 清洗3 次，用质量分数为0.01%的DAPI 染色，倒置显微镜拍照计数。

1.5.2 Transwell 侵袭实验 从-20℃取出Matrigel胶，4℃冷却融化，并用4℃预冷的无血清培养基按照1∶3的比例稀释Matrigel 胶，将稀释后的溶液加入上室，其余步骤与迁移实验相同。

1.6 细胞周期和凋亡检测

取2 mL 浓度为1×106/mL的细胞悬液接种于6 孔板，转染siRNA。将细胞悬液离心后用70%酒精于-20℃固定24 h，随后离心并加入RNaseA 去除RNA，再用碘化丙钠（PI）在黑暗中染色30 min，流式细胞仪测定细胞周期分布。

表1 qRT-PCR引物及序列

收集转染后的细胞，制作单细胞悬液，离心去上清。加入预冷的PBS 洗涤细胞2 次，去上清，然后加入1 mL 1×结合缓冲液重悬细胞。取100 μL 加入5 mL 培养管中，加入5 μL FITC 标记的AnnexinⅤ和5 μL PI 混匀后室温下避光孵育15 min，再加入400 μL 1×结合缓冲液。流式细胞仪分析检测细胞凋亡。

1.7 萤光素酶报告基因检测

用LipofectAMINE 2000 将含有野生或突变circCMTM3的pmirGLO质粒和miR-588 mimic 共转染细胞。48 h后，用双萤光素酶报告试剂盒测定萤光素酶活性。

1.8 统计学分析

采用GraphPad Prism 7 对实验数据进行统计学分析，至少3个独立实验的数据以x±s表示，统计检验数据符合正态分布。2组间差异采用t检验，3 组及3 组以上采用方差分析。双尾值P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circCMTM3在骨肉瘤细胞中的高表达

在不同骨肉瘤细胞中检测circCMTM3的表达，发现circCMTM3在骨肉瘤细胞中的表达量均高于正常成骨细胞中（图1）。3种骨肉瘤细胞系中，G-292细胞中的circCMTM3表达最高，因此选用G-292细胞进行circCMTM3 功能检测。

2.2 沉默circCMTM3 对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响

为了探究circCMTM3在骨肉瘤细胞中的功能，对G-292细胞进行circCMTM3 沉默，随后通过CCK-8和Transwell检测，结果如图2，circCMTM3沉默后，细胞增殖、迁移和侵袭能力均明显降低。该结果说明circCMTM3 参与骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭过程，发挥促癌作用。

2.3 沉默circCMTM3 对骨肉瘤细胞周期和凋亡的影响

流式细胞术检测circCMTM3 是否影响骨肉瘤细胞周期和凋亡情况。结果表明，circCMTM3表达降低使G1 期细胞增加，而S 期细胞减少，敲除circCMTM3 抑制了细胞周期进展，但促进了细胞凋亡（图3）。这些结果显示，circCMTM3 促进细胞周期进展，并减少了细胞凋亡。

2.4 circCMTM3 是miR-588的miRNA海 绵

图1 circCMTM3在骨肉瘤细胞Huo9、G-292、Saos2和成骨细胞hFOB1.19 中的表达

图2 沉默circCMTM3 影响骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭

研究表明circRNA 常作为miRNA海绵调控miRNA的表达，从而参与细胞功能。通过starBase数据库预测了含有circCMTM3 结合位点的4 条miRNA，分 别 为miR-4701-5p、miR-588、miR-1224-5p和miR-577。图4A 结果显示，circCMTM3敲除对miR-588表达影响显著，而对其他影响不大。为了进一步验证circCMTM3和miR-588 两者的靶向作用关系，我们通过萤光素酶检测发现miR-588 mimic 显著降低了正常组（WT）萤光素酶活性，而对突变组（MUT）无影响（图4C）。miR-588在骨肉瘤细胞中低表达（图4D），与circ⁃CMTM3在骨肉瘤细胞中的表达情况相反。综上，circCMTM3 是miR-588的miRNA海 绵。

2.5 circCMTM3 通过海绵miR-588 促进骨肉瘤细胞迁移和侵袭

为了检测miR-588在骨肉瘤中的功能以及对circCMTM3 功能的影响，我们通过过表达miR-588和/或circCMTM3 并检测骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力发现，单独过表达circCMTM3 促进了骨肉瘤细胞的迁移和侵袭，单独过表达miR-588 抑制了细胞的迁移和侵袭，而过表达circCMTM3 消除了miR-588 过表达对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的抑制作用（图5）。这些结果表明，circCMTM3在骨肉瘤细胞中通过调控miR-588 而起到促癌作用。

图3 沉默circCMTM3 影响骨肉瘤细胞周期和凋亡

图4 circCMTM3 是miR-588的miRNA海绵

图5 circCMTM3 通过海绵miR-588 促进骨肉瘤细胞迁移和侵袭

3 讨论

circRNA 已被鉴定为包括癌症在内的不同类型疾病的新型生物标志物和潜在的治疗靶点。研究显示circRNA在肿瘤发生、生长和转移过程中发挥十分重要的作用[8-10]。hsa_circ_0001361 通过miR-491-5p/MMP9 轴促进膀胱癌的侵袭和转移[11]；hsa_circ_0078710 作为miR-31的海绵，促进肝癌进展[12]。最近的一项研究发现circ_0008450在肝癌组织和细胞中的表达高于相应的非肿瘤组织和细胞系，且circ_0008450 高表达的患者具有严重的临床特征，包括肿瘤大小和TNM 分期较高[13]。本研究结果表明circCMTM3 同样在骨肉瘤细胞中高表达，circCMTM3的敲除显著抑制骨肉瘤细胞的生长、迁移和侵袭，并刺激了细胞凋亡。因此，circCMTM3在骨肉瘤中具有促癌作用。

circRNA 可以通过海绵miRNA间接发挥其生物学功能。例如，Li 等发现上调的circ_0016760可以通过miR-1287/GAGE1 轴促进细胞进程[14]；circ-FOXP1 通过海绵化miR-875-3p和miR-421促进肝癌进展[15]。本研究中，我们通过starBase 数据库预测了可能被circCMTM3 海绵的miRNA分别为miR-4701-5p、miR-588、miR-1224-5p和miR-577，其中只有miR-588的表达显著受circCMTM3影响。我们通过萤光素酶报告试验进一步验证circCMTM3 能够靶向海绵miR-588。

Zhou 等[16]研究发现miR-588在胃癌中低表达且抑制肿瘤细胞的迁移。Yu 等[17]研究发现miR-588在乳腺癌中也具有抗肿瘤作用，是治疗乳腺癌的潜在治疗靶点。本研究结果显示miR-588在骨肉瘤细胞中低表达，并通过回复实验发现，单独过表达circCMTM3 促进了骨肉瘤细胞的迁移和侵袭，miR-588 过表达抑制了细胞的迁移和侵袭，而过表达circCMTM3 通过海绵作用抑制miR-588的功能。这些结果表明，circCMTM3的致癌作用部分依赖于其对miR-588的调节，circCMTM3/miR-588p 轴有助于骨肉瘤进展。但miR-588的具体作用机制仍待进一步探讨。

综上所述，circTMCM3在骨肉瘤细胞中高表达，并通过海绵miR-588 发挥致癌作用，这项研究可能为骨肉瘤提供新的潜在治疗途径。