诱导型神经干细胞移植抑制颅脑创伤后补体活化的影响

高谋 徐如祥 王文佳 董勤 丁柏匀 姚慧 杨志军

补体系统是免疫系统的重要组成部分，补体系统激活可产生多种生物活性物质介导颅脑创伤（traumatic brain injury，TBI）后炎症反应，也可形成补体膜攻击复合物（C5b-9）加重神经细胞损伤[1,2]。近年来，研究发现中枢神经系统（central nervous system，CNS）内星形胶质细胞和小胶质细胞可表达补体调节分子 Crry、Cd46、Cd59a和 Cd55，减轻补体活化介导的细胞损伤[3,4]。然而，由于神经细胞选择性低表达补体调节分子，因此其易遭受补体系统的攻击[3,4]。此外，在CNS疾病模型的脑组织中少见补体调节分子表达，而可见大量补体活化产物C3d和C5b-9沉积于神经细胞上，因而调控TBI后补体活化可减轻补体介导的神经细胞损伤[3-5]。笔者曾报道经立体定向颅内移植的诱导型神经干细胞（induced neural stem cells，iNSCs）可通过调控小胶质细胞活化状态，抑制反应性星形胶质细胞增生，抑制TBI后炎症反应，为神经细胞存活创造适宜的微环境[6,7]。然而，目前国内外少有研究报道iNSCs移植对TBI后补体活化的调节作用。为此，本研究用自由落体脑打击装置制备C57BL/6小鼠TBI模型，并将C57BL/6小鼠iNSCs经静脉注射到TBI小鼠体内，观察脑组织中C3d和NeuN抗体双阳性、C5b-9和NeuN抗体双阳性、C3d和Map2抗体双阳性以及C5b-9和Map2抗体双阳性的神经细胞的分布情况，并用流式细胞仪检测经TBI小鼠血清处理后iNSCs表达补体调节分子的水平，探讨经静脉移植iNSCs对TBI后补体活化的作用及分子机制，现报道如下。

材料与方法

一、实验动物

健康成年雄性C57BL/6小鼠40只，8～10周龄，体质量24～30 g，所有实验动物（无特定病原体级）均购自北京维通利华公司。

二、主要实验仪器和试剂

仪器：CO2细胞培养箱（Thermo公司，美国），超净工作台（ESCO公司，美国），倒置相差显微镜、CM1950冰冻切片机、TCS SP5Ⅱ激光共聚焦显微镜和DM3000荧光显微镜（Leica公司，德国），C6流式细胞仪（BD Biosciences公司，美国）。

试剂：DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、B27、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、Accutase 酶、左旋谷酰胺和磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）（Invitrogen 公司，美国），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（Sigma 公司，美国），C3d 抗体（工作浓度：5 μg/mL）（R&D Systems公司，美国），C5b-9 抗体（工作浓度：2 μg/mL）、Map2 抗体（工作浓度：2 μg/mL）、Cd46 抗体（工作浓度：10 μg/mL） 和兔 IgG，polyclonal Isotype Control抗体（工作浓度：10 μg/mL）（Abcam 公司，美国），NeuN 抗体 （工作浓度：5 μg/mL）（Millipore 公司，美国），Alexa Fluor®555标记驴抗山羊C3d抗体（工作浓度：2 μg/mL）、Alexa Fluor®555 标记山羊抗兔 C5b-9 抗体（工作浓度：2 μg/mL）、Alexa Fluor®633标记山羊抗鸡 Map2抗体 （工作浓度：2 μg/mL）和Alexa Fluor®633标记山羊抗小鼠NeuN抗体（工作浓度：2 μg/mL）（Life Tech 公司， 美国），4’，6-二脒基-2-苯 基 吲 哚 （4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（SouthernBiotech 公司，美国），Crry 抗体（工作浓度：5 μg/mL）、 大鼠 IgG2α，κ Isotype Control抗体（工作浓度：5 μg/mL）和APC标记山羊抗大鼠IgG抗体 （工作浓度：2 μg/mL）、PE 标记仓鼠抗小鼠Cd55抗体 （工作浓度：2 μg/mL）和 PE标记仓鼠IgG3，λ1 Isotype Control抗体 （工作浓度：2 μg/mL）（BD Biosciences公司，美国），APC标记山羊抗兔IgG 抗体（工作浓度：5 μg/mL）（Thermo 公司，美国），PE标记抗小鼠Cd59a抗体 （工作浓度：2 μg/mL）和PE标记小鼠IgG1，κ Isotype Control抗体 （工作浓度：2 μg/mL）（Biolegend 公司， 美国），PE 标记仓鼠抗小鼠 Cd55抗体（工作浓度：2 μg/mL）和 PE标记仓鼠 IgG3，λ1 Isotype Control抗体（工作浓度：2 μg/mL）（Biolegend 公司，美国）。

三、C57BL/6小鼠iNSCs体外培养

C57BL/6小鼠 iNSCs用含 2%B27、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、0.05%BSA 和 2 mmol/L 左旋谷酰胺的DMEM/F12与Neurobasal等体积混合培养基培养。

四、C57BL/6小鼠TBI模型制备和iNSCs移植

用异氟烷气体麻醉剂麻醉小鼠，并将其固定于脑立体定向仪上，备皮消毒，铺无菌洞巾，切开皮肤，暴露前囟，以lambda缝向喙侧2.0 mm、中线偏右侧2.0 mm为撞击点。用自由落体脑打击装置，撞针直径3.0 mm，制备TBI模型。设置假手术（sham）组（10只），仅切开头皮，不实施撞击。于伤后1 h对TBI小鼠进行神经功能缺损评分 （neurologicalseverityscore，NSS），将 NSS 为 4～8 分者（30 只）纳入 TBI组，按照随机数字表法选取10只用于制备TBI小鼠血清和热灭活TBI小鼠血清；余下20只按照随机数字表法分为：iNSCs移植组（10只）和 PBS处理组（10只）。于TBI后12 h，用Accutase酶消化法制备iNSCs单细胞悬液，并用PBS漂洗3遍，用PBS重悬细胞，并分别将200 μL含5×106个iNSCs单细胞悬液或等体积PBS经尾静脉注射到TBI小鼠体内。

五、脑组织冰冻切片、病理染色和双重免疫荧光染色

细胞移植后7 d采用随机数字表法从各组中选取6只动物进行处死，灌注固定后取出大脑，并作大脑冠状面连续冰冻切片，切片厚度为10 μm。用苏木素-伊红染色观察脑组织病理形态学特征。根据病理染色结果挑选脑组织切片进行双重免疫荧光染色，用10%BSA/0.3%TritonX-100封闭1 h后，分别加入 C3d 抗体（工作浓度：5 μg/mL）、C5b-9 抗体（工作浓度：2 μg/mL）、Map2 抗体 （工作浓度：2 μg/mL）和NeuN 抗体（工作浓度：5 μg/mL）在 4℃孵育过夜。用PBS漂洗后，分别加入Alexa Fluor®555标记驴抗山羊 C3d 抗体 （工作浓度：2 μg/mL）、Alexa Fluor®555标记山羊抗兔C5b-9抗体（工作浓度：2 μg/mL）、Alexa Fluor®633标记山羊抗鸡Map2抗体（工作浓度：2 μg/mL） 和 Alexa Fluor®633标记山羊抗小鼠NeuN 抗体（工作浓度：2 μg/mL），室温避光孵育 2 h。用DAPI染细胞核，封片后，在荧光显微镜下观察，在20×镜下随机选取6个视野，计数阳性细胞数（特异性抗体标记）和总细胞数（DAPI标记），阳性细胞百分率（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%。

六、流式细胞仪检测

于TBI后12 h，分别制备TBI小鼠血清和热灭活TBI小鼠血清。用Accutase酶消化法制备iNSCs单细胞悬液，用PBS漂洗后离心弃去上清，分别用250 μL的TBI小鼠血清和热灭活TBI小鼠血清重悬细胞，接种于24孔板（细胞密度为1×105个/孔），置于37℃培养箱中处理45 min。随后收集细胞悬液，离心后弃去上清。用PBS漂洗3次，分别加入Crry 抗体 （工 作 浓度 ：5 μg/mL）、 大 鼠 IgG2α，κ Isotype Control抗体（工作浓度：5 μg/mL）和 APC 标记山羊抗大鼠 IgG抗体（工作浓度：2 μg/mL），避光放置在4℃冰箱。反应20～30 min后，用PBS漂洗3次，并用PBS重悬细胞。用C6流式细胞仪检测，每个样品收集10 000～20 000个细胞。计算平均荧光强度分析iNSCs表达Crry水平。

七、统计学分析

采用SPSS17.0软件进行统计学分析。小鼠脑内C3d和NeuN抗体双阳性、C5b-9和NeuN抗体双阳性、C3d和Map2抗体双阳性以及C5b-9和Map2抗体双阳性的神经细胞数量以及iNSCs中Crry平均荧光强度以均数±标准差（±s）表示，资料先进行正态性检验和方差齐性检验，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、INSCs移植物抑制 TBI小鼠脑内 C3d和C5b-9沉积于NeuN和Map2抗体阳性的神经细胞

在TBI后7 d，sham组小鼠脑组织中少见C3d和NeuN抗体双阳性、C5b-9和NeuN抗体双阳性、C3d和Map2抗体双阳性以及C5b-9和Map2抗体双阳性的神经细胞（图1）。与之相比，TBI小鼠脑组织中明显可见C3d和C5b-9沉积于NeuN和Map2抗体阳性的神经细胞 （图1）。经统计分析发现：与sham组相比，PBS处理组和iNSCs移植组小鼠脑组织中C3d和NeuN抗体双阳性、C5b-9和NeuN抗体双阳性、C3d和Map2抗体双阳性以及 C5b-9和Map2抗体双阳性的神经细胞数量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与 PBS 处理组相比，iNSCs移植组小鼠脑组织中C3d和NeuN抗体双阳性、C5b-9和NeuN抗体双阳性、C3d和Map2抗体双阳性以及C5b-9和Map2抗体双阳性的神经细胞数量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。

图1 颅脑损伤7 d后的PBS处理组、iNSCs移植组和sham组小鼠脑组织双重免疫荧光染色检测（×400）

二、流式细胞仪检测iNSCs表达补体调节分子水平

TBI小鼠血清组和热灭活TBI小鼠血清组中iNSCs表达补体调节分子Cd46、Cd59a和Cd55水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与热灭活TBI小鼠血清组相比，TBI小鼠血清组中iNSCs表达补体调节分子Crry水平明显上调，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表 2）。

讨 论

TBI是CNS损伤性疾病，其流行病学特点呈现为高发病率和高致死、致残率，严重危害人类生命健康[8]。有研究表明，TBI后继发性脑损伤是由多种因素参与的复杂病理过程，直接影响患者预后，如何有效防治TBI后继发性脑损伤是医学研究的热点和难点[8,9]。补体系统作为免疫系统的重要组成部分，可参与机体的免疫调节和病理损伤反应，因此调控TBI后补体活化可减轻补体介导的神经细胞损伤，为防治TBI后继发性脑损伤提供帮助[10,11]。目前，调控补体活化的方法主要是补体抑制剂和基因靶向药物的应用，然而其抑制TBI后补体活化的疗效并不理想[12,13]。为此，本课题组探讨了iNSCs移植对TBI后补体活化的影响，结果发现：与既往文献报道相符，在正常动物CNS内，即在sham组小鼠脑组织中，补体活化产物C3d和C5b-9表达量较低[14,15]。而当CNS损伤后，即在TBI小鼠脑组织中，可观察到大量补体活化产物C3d和C5b-9沉积于神经细胞上。补体活化产物C3d和C5b-9来源广泛，可从外周血液循环中经功能紊乱的血脑屏障渗漏，也可由浸润的免疫细胞或CNS内固有细胞合成[5]。此外，本研究发现，各组内NeuN阳性和Map2阳性的神经细胞上沉积的补体活化产物C3d和C5b-9具有一致性，说明TBI后神经细胞的胞体与轴突均遭受补体系统的攻击。值得注意的是，接受经静脉移植iNSCs的TBI小鼠脑组织中，NeuN阳性和Map2阳性的神经细胞上沉积的补体活化产物C3d和C5b-9均明显少于接受PBS处理的TBI小鼠。由此可见，iNSCs移植物可抑制TBI后补体活化，减轻补体活化对神经细胞的损伤。

为探讨经静脉移植iNSCs抑制TBI后补体活化的分子机制，本研究制备了TBI小鼠血清和缺乏补体活性成分的热灭活TBI小鼠血清分别在体外处理iNSCs，而后用流式细胞仪检测iNSCs表达补体调节分子的水平。与既往文献报道“干细胞可表达补体受体 CR2、C3aR和 C5aR以及补体调节分子 Crry、Cd46、Cd55和Cd59”一致，本研究发现 TBI小鼠血清处理后，iNSCs表达补体调节分子Crry的水平明显上调[16,17]。Crry是啮齿类动物调节补体活化的重要成分，类似于人类补体调节分子Cd46和Cd55[18,19]。可见Crry具有抑制C3转化酶的作用，从而调控补体系统激活，并减少下游补体活化产物C3d和C5b-9的形成[20-22]。本研究结果提示：经静脉移植iNSCs可能通过增加Crry的表达量，发挥抑制补体活化的作用。此外，经TBI小鼠血清处理的iNSCs选择性上调Crry的表达量也是本研究的新发现。

表1 颅脑损伤7 d后的各组小鼠脑内特异性抗体标记细胞的百分率（±s，%）

表1 颅脑损伤7 d后的各组小鼠脑内特异性抗体标记细胞的百分率（±s，%）

与 sham 组比较，aP＜0.05；与 iNSCs移植组比较，bP＜0.05

?

表2 流式细胞仪检测iNSCs表达补体调节分子的水平

综上所述，经静脉移植iNSCs可抑制TBI后补体活化，减少补体活化产物C3d和C5b-9沉积于神经细胞的胞体和轴突，从而减轻补体活化介导的神经损伤。通过体外实验，笔者注意到iNSCs可接受TBI小鼠血清刺激，选择性上调补体调节分子Crry的表达量，而理论上补体调节分子Crry可发挥抑制补体活化，减少补体活化产物C3d和C5b-9形成的作用，为进一步探讨经静脉移植iNSCs抑制TBI后补体活化的作用机制提供了新的方向。因此，在后续研究中，笔者仍将重点关注iNSCs选择性上调补体调节分子Crry表达量的分子机制，以及Crry表达量与TBI后补体活化水平间的量效关系，进而揭示iNSCs移植物抑制TBI后补体活化的分子机制。