干预细胞死亡在肾脏病治疗中的研究进展

汤 雄，张 炯综述，王金泉审校

作者单位：210002南京，南京大学医学院附属金陵医院（东部战区总医院）国家肾脏疾病临床医学研究中心全军肾脏病研究所[汤 雄（医学硕士研究生）、张 炯、王金泉]

0 引 言

肾病通常按起病方式和临床转归可分为慢性肾病（chronic kidney disease，CKD）和急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）。AKI和CKD既互相有区别，又互相联系，一方面CKD是AKI发生的高危因素，另一方面AKI也可进展至 CKD［1］。2004年美国公共卫生调查数据显示，成年人中CKD的发病率约为14%［2］，对中国人群的大型流行病调查表明中国成人CKD发病率为10.8%［3］，随着人口老龄化及社会环境的变迁中国成人CKD发病率有可能进一步上升。而AKI作为患者死亡风险的高危因素，一项针对四大洲AKI事件的Meta分析指出，心脏手术、重症监护、创伤及社区获得的成人AKI综合死亡率23.9%，儿童为13.8%［4］。然而目前的临床用药难以涵盖不同病因、不同病理改变的CKD及AKI，难以逆转CKD的进展及在此基础上AKI的发生。最近，对一些肾疾病动物模型的研究结果发现，细胞死亡在疾病发生发展过程中发挥重要作用。因此，学界提出针对细胞死亡与生存调控异常的潜在靶点。本文主要对近年来在细胞死亡与生存异常调控方面的研究进展以及干预细胞死亡与生存异常调控在CKD和AKI病理生理过程中可能发挥的疗效作一综述。

1 肾病中的细胞死亡通路

1.1 外源性和内源性凋亡通路 细胞凋亡是一个受到严密调控的细胞程序性死亡过程，其中半胱天冬酶依赖的细胞凋亡可由内源性或外源性因素刺激启动［5］。内源性因素包括细胞应激、发育信号以及生长因子下调等，这些刺激可导致包括线粒体损伤在内的细胞完整性受到破坏。Bcl-2家族蛋白在内源性细胞凋亡线粒体通路调节中起关键作用，其中促凋亡因子（如Bim或Bid）和效应因子（如Bak和Bax）能抵消抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1的抑制作用。当平衡被打破倾向于凋亡时，Bcl-2会释放细胞色素C，形成凋亡复合体1（Apaf-1），并活化半胱天冬酶-9（caspase-9）。活化的caspase-9随后激活caspase-3和 caspase-7，从而导致细胞死亡［6］。目前多借助于Bax-或Bak-缺陷小鼠来观察线粒体凋亡通路在肾脏损伤中的作用。在缺血性急性肾损伤的小鼠模型中，敲除Bax或Bak基因能抑制肾小管上皮细胞凋亡，对肾起部分保护作用［7］。

肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族的死亡配体与细胞表面含死亡结构域的TNF受体（TNFR）结合启动外源性细胞凋亡通路，并募集各类因子形成受体相关的死亡诱导信号复合物。死亡受体4和5（death receptor，DR4、DR5）以及Fas共同募集配体蛋白Fas相关死亡结构域（fas-associated protein with death domain，FADD），与受体相互作用蛋白1（receptor interaction protein，RIP1）结合，进而引起caspase-8激活及其下游效应因子caspase-3和caspase-7活化［8］。TNFR1和DR3在其受体复合物中结合其他蛋白质分子，包括TNFR相关死亡结构域、RIP1、TNFR相关因子2和细胞凋亡抑制剂（c-IAP1、c-IAP2）。c-IAP1和c-IAP2通过各种连锁反应使受体相互作用蛋白1泛素化，TNFR1受体相关复合体中K63-和K11-连接的多聚泛素链是其中最重要的一条［9］。研究证实通过去泛素化酶A20去除RIP1中的c-IAP蛋白或泛素化基团可形成完整的具有功能的复合体Ⅱ，继而活化caspase-8并导致细胞凋亡［10］。抑制性caspase-8样分子FLICE-抑制蛋白也可阻断这条通路，通过与caspase-8竞争性结合FADD，并募集凋亡受体复合物来抑制凋亡受体-凋亡途径的活化［11］。外源性和内源性凋亡通路最终都是由活化效应因子caspase-3和caspase-7，从而介导细胞凋亡［12］。

尽管TNF配体和TNFR受体超家族极大地影响肾损伤时的细胞存活和炎症反应，但单个配体或受体的功能并不完全清楚，且与其他凋亡配体和受体相比，Fas在缺血性急性肾损伤细胞凋亡和炎症反应中可能发挥更大的作用［13］。目前肾病理学研究中的最引人关注的TNF家族成员为TNF相关配体TNF样弱凋亡诱导因子（TNF-like weak inducer of ap-optosis，TWEAK）。TWEAK通过经典或非经典核因子-κB以及丝裂原活化的蛋白激酶信号通路，促进细胞凋亡和炎症反应［14］。抗TWEAK抗体作为一种组织细胞保护策略在狼疮性肾炎中的疗效正处于临床试验阶段［15］。

1.2 调节性细胞坏死 半胱天冬酶活性受到抑制能够中止TNFR1介导的细胞凋亡信号通路，在这种情况下，细胞可进入另一条死亡途径——坏死性凋亡。坏死性凋亡是由TNF信号启动的可调节性细胞坏死，受RIP1和RIP3激酶调节［16］。除TNF，病原体识别受体、Toll样受体、核苷酸结合寡聚化结构域样受体以及RNA解旋酶也可诱导坏死性凋亡。一旦调亡诱导信号复合体形成，RIP1和RIP3就会发生一系列自磷酸化和交叉磷酸化反应，磷酸化的RIP3可结合并磷酸化混合系蛋白激酶样结构域（mixed lineage kinase domain-like，MLKL），这是诱导坏死性细胞凋亡的最关键步骤，MLKL的磷酸化能触发自身寡聚化并向质膜易位从而促进坏死性细胞凋亡［17］。RIP1激酶抑制剂（necrostatin-1）或RIP3激酶抑制剂可导致激酶失活，从而阻断坏死性凋亡［18］。

借助于necrostatin-1和RIP3的基因敲除已经证实坏死性凋亡部分参与了肾损伤过程。necrostatin-1能有效减轻小鼠急性肾损伤以及降低血尿素氮和肌酐水平，RIP3缺陷小鼠同样也能有效减轻肾缺血-再灌注急性肾损伤［17］。对小鼠肾移植模型研究表明，与对照组相比，接受来自RIP3基因敲除（供体）的移植肾小鼠存活期更长，移植肾功能更好，从而表明供肾中RIP3介导的坏死性凋亡以及其他死亡信号通路活化能够促进炎性肾损伤［19］。因而，有理由相信针对RIP1和（或）RIP3的靶向治疗，是减轻缺血-再灌注肾损伤和提高移植肾存活率的一种潜在治疗策略。

1.3 其他类型死亡通路 与坏死性凋亡不同，细胞焦亡是一种程序性细胞死亡过程，当组织出现炎症反应时，caspase-1和caspase-11（小鼠）或caspase-4和caspase-5（人），可引起细胞迅速肿胀和溶解，最终导致细胞内炎性复合体的释放，进一步导致炎症反应扩散［20］。最近的遗传学研究表明，caspase-11作为细胞焦亡的关键，能够引发细胞的死亡，而caspase-1则介导IL-1β和IL-18的分泌，促进炎症扩散。Caspase-1和caspase-11能够裂解gasdermin D（gsdmD），使后者N端和C端的结构域分开，N端片段可识别并结合细胞膜的磷脂类分子，在细胞膜上形成孔隙，导致细胞渗透压的变化，出现细胞裂解、焦亡［21］。Zhan等［22］对小鼠肾缺血-再灌注损伤的研究显示，损伤后肾组织中caspase-1，caspase-11和IL-1β的表达增加，提示肾缺血-再灌注损伤中可能存在细胞焦亡。对选择性caspase-11抑制剂和caspase-1/11双敲除小鼠的进一步研究，将有助于更全面的认识细胞焦亡对肾缺血-再灌注损伤的作用。

线粒体与固有的细胞凋亡通路相关［11］；此外，由离子、核苷酸、活性氧自由基和其他因素激活的线粒体膜通透性改变（mitochondrial permeability transition，MPT）也可导致坏死性细胞死亡。线粒体跨膜通道的开放称为MPT，受亲环蛋白D（cyclophilin D，CYPD）的调节，CYPD为可被免疫抑制剂环孢菌素A或萨菲菌素A抑制的蛋白质［23］。对CypD基因敲除小鼠肾损伤的研究，结果发现CypD基因敲除可减少坏死性凋亡，进而减轻小鼠IRI肾损伤，提示小鼠IRI肾损伤可能存在MPT［24］。更有意义的是，在IRI模型中，CypD和RIP3基因的双敲除可较任一单一基因敲除有更大的获益。RIP1抑制剂-1和MPT抑制剂萨菲菌素A的联合应用也证实了上述研究结论，表明肾缺血-再灌注损伤中可能同时存在的两种独立的调节性坏死途径［25］。

依赖于铁和谷胱甘肽代谢的调节性细胞坏死，称之为铁凋亡（ferroptosis），是另一种细胞死亡方式。铁凋亡引起ROS的积聚，并能够被ferrostatin-1抑制。Ferrostatin-1能有效阻断IRI引起的肾小管损伤，并降低血清尿素氮和肌酐水平。此外，ferrostatin-1能阻止肾近端肾小管上皮细胞死亡，同时减少氧化损伤后ROS的产生［26］。基于ferrostatin-1上述肾保护作用，铁凋亡可能是缺血-再灌注肾损伤机制之一，可作为缺血-再灌注肾损伤的潜在治疗靶点。

由紫外线、ROS或烷基化剂诱导的DNA损伤能激活多腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP1），有助于损伤的修复。但PARP1过度活化可引起parthanatos——PARP1依赖的细胞死亡［27］。对单侧输尿管结扎小鼠模型研究发现，与野生型相比，PARP1敲除小鼠肾间质纤维化明显减轻，炎性因子前体表达明显减弱，表明PARP1在梗阻性肾损伤中介导了坏死性细胞死亡，主要表现为肾间质纤维化与促进炎性信号传导［28］。同样，PARP1缺乏能减少顺铂诱导的肾功能损伤，氧化应激、促炎性因子诱导的肾小管坏死［29］。上述研究表明PARP1可能是梗阻性肾损伤和其他肾毒性肾损伤的潜在治疗靶点。

其他形式的细胞死亡，如失巢凋亡和自噬性细胞死亡，与肾病的联系并不明确。越来越多的证据显示，大多数肾病理损害不能归因于与某一种单一的细胞死亡通路。大多数情况下，肾损伤时会有两个或两个以上的细胞死亡通路激活，致使对疾病过程和致病机制的理解难度增加，同时也不利于发现最有效的治疗方法。最典型的是足细胞，作为一种高度分化的上皮细胞，在足细胞中几乎能观察到所有的细胞死亡通路［30］。尽管存在诸多困难，良好的实验动物模型，借助于基因敲除和特异性化学抑制剂，可以最大程度地理解各种细胞死亡途径在特定肾病理过程的意义。

2 干预AKI细胞死亡通路

按病变部位AKI可分为肾前性，肾性及肾后性，按病理改变也可分为急性间质性肾炎及急性肾小管坏死，病因又能够分为肾毒性药物性、肾缺血等，鉴于AKI发生的病因、病理多样性，AKI最为有效的治疗应该是对高危患者的预防。尽管目前尚无针对性的临床药物，缺乏临床试验，一些研究也显示靶向干预细胞死亡通路活化药物疗效有限，并不能减轻、消除类似缺血-再灌注损伤导致的细胞死亡和/或肾损害［31-33］。但干预细胞死亡预防和治疗AKI存在扎实的理论基础，如移植肾功能延迟恢复最常见原因是缺血-再灌注损伤，可导致细胞凋亡通路的激活从而对移植肾带来不良后果。对AKI过程中细胞死亡通路更深入的认识及更加精准的靶药物治疗，将为AKI的治疗提供新的思路及治疗策略。

3 干预肾病相关细胞死亡通路

根据肾病理生理学特性，针对细胞死亡通路的治疗着重于阻止细胞死亡的发生，同时抑制细胞死亡相关因子的释放，从而阻断这些因子促进炎症的发生发展。既往研究显示在RIP1和RIP3激酶介导的调节性坏死过程中，RIP3起主导作用。但最近的研究表明，RIP3激酶基因敲除或化学抑制可以诱导细胞凋亡，最终导致突变动物死亡［17］。MLKL作为另一种坏死性调节因子，与RIP1和RIP3不同，MLKL不具有可识别酶活性，因此很难成为药物干预靶点［18］。不排除未来会发现一些小分子化合物，可选择性阻断坏死性凋亡细胞信号诱导的MLKL构象变化，并将MLKL易位到胞膜中，从而阻止坏死性细胞死亡。

RIP1作为上述通路中的第三种坏死性调节因子，是一种通路顶端激酶，可调控大多数的坏死性凋亡的应答。与RIP3不同，RIP1激酶功能突变并不会对细胞或动物有任何不利的影响。迄今发现的小分子RIP1激酶抑制剂具有极高的选择性，在动物模型中证实安全性好［32］。RIP1激酶抑制剂同样具有较高安全性，RIP1激酶在坏死性凋亡炎症通路中具有重要的功能，这些特征使RIP1为一个几乎完美的治疗靶点。已有药企将RIP1作为小分子激酶抑制剂的靶目标，进一步将开展临床研究以证实以RIP1激酶活性为干预目标在肾脏病理学改变上是否有效果。

除细胞凋亡和坏死性凋亡，细胞焦亡、parthanatos、MPT介导的细胞死亡和铁凋亡等也在肾病发生发展中起作用。虽然细胞焦亡的确切作用有待临床验证，但在动物模型中已经获得了令人振奋的研究结果，将CYPD、PARP1或铁凋亡等通路作为目标可能成为干预肾病的新策略。目前优化铁凋亡抑制剂ferrostatin-1，以验证其逆转缺血-再灌注肾损伤中的氧化应激相关损害的研究正在进行中。以CYPD和MPT介导的细胞死亡为靶点的药物已经用于治疗炎症性疾病及预防器官移植排斥反应。有理由相信未来也可以通过环孢素A或萨菲菌素A来治疗多种肾病，包括肾病综合征和急性肾损伤。

4 结 语

综上所述，干预细胞死亡通路作为肾病治疗的新策略，进一步建立可靠的动物模型、临床前研究及良好设计的临床实验将会显示以干预细胞死亡通路为目标的确切疗效。如同大多数癌症患者接受多种抗癌药物的联合治疗一样，肾病患者也能从多种细胞死亡抑制剂联合使用中获益。同时，寻找发现确切的具有诊断性及预后判断性生物标记物至关重要。在急慢性肾损伤致病机制、动物模型和临床研究中仍需付出更多的努力，以发现能够直达病灶、直击致病机制靶点的真正有效的药物，给予肾病患者带来新的曙光。