肠道微生物在肿瘤治疗中的作用

欧阳洋，吴 奇综述，孙圣荣审校

作者单位：430060武汉，武汉大学人民医院乳腺甲状腺外科[欧阳洋（医学硕士研究生）、吴 奇、孙圣荣]

0 引 言

肠道微生物组成在外周免疫系统及肿瘤微环境中具有重要影响。人类肠道菌群有3×1013个细菌，这些细菌对机体健康具有重要作用，它们参与了营养物质的降解、外源性物质的清除、肠道上皮细胞的增殖和分化、局部蠕动、定殖抗性与病原体的消灭以及我们免疫系统的成熟［1］。流行病学上已证实肠道微生物群失调与多种慢性炎症性疾病有关［2］。此外，微生物群还参与肿瘤的发生、发展、转移及机体对抗肿瘤治疗的反应［3］。文章综述了肠道微生物在肿瘤化疗与免疫治疗中的作用，以及微生物干预在肿瘤治疗中的应用前景与挑战。

1 微生物在癌症中的作用

肠道微生物群不仅在局部发挥着重要作用，如调节营养吸收、维生素合成、胆汁和激素的代谢以及碳水化合物的发酵，加强肠道屏障作用和促进局部免疫的建立。此外，肠道微生物在体内还发挥着全身作用，其通过产生信号分子，刺激骨髓和淋巴细胞，调节机体对炎症刺激、感染、疫苗和自身免疫的反应［3-4］。例如，微生物来源的丁酸盐可诱导T细胞转化为Treg细胞。Treg细胞的抗炎功能可减缓炎症驱动的肿瘤形成，此外，Treg细胞也可浸润至肿瘤微环境中，发挥免疫抑制作用，削弱机体的抗肿瘤反应［5］。细菌产物也可以诱导Ⅱ型干扰素的表达，从而影响中性粒细胞的激活［6］。低浓度的微生物相关分子模式，如脂多糖，可改变骨髓细胞活化阈值，增强炎症反应［7］。

微生物可通过产生有毒代谢产物或致癌物、诱导炎症及抑制机体免疫功能，促进癌症的发生。例如，某些脆弱拟杆菌和大肠埃希菌可通过产生毒性代谢产物直接影响结肠中的肿瘤发育［8-9］。然而，越来越多的证据表明，细菌可通过增强宿主抗肿瘤免疫作用，对非肠道癌症发挥着积极的抗肿瘤作用。例如，Rosshart等［10］发现，将野生小鼠肠道微生物转移至SPF条件下饲养的小鼠后，SPF小鼠的免疫调节作用增强，并可抵抗致癌物的致癌作用。控制宿主-微生物交联的基因缺陷的小鼠被广泛用于微生物群影响癌症的机制研究中。缺乏相关基因的小鼠，如Tlr5、IL-10、Tbx1和Rag2，不仅易发生结肠炎和结肠癌，且以肠道失调为主要特征。而野生型小鼠在与这类小鼠共住或进行粪便移植后，也会产生癌症易感性［11-12］。抗生素的使用可减少肠道菌群的多样性，诱导肠道失调，使患病风险增加。在原癌基因HER2/neu的转基因小鼠中，长期联合使用甲硝唑和环丙沙星的抗生素治疗使乳腺癌发病率增加了3倍［13］。此外，有关5项乳腺癌病例对照研究的荟萃分析显示，抗生素的使用与乳腺癌风险略有升高相关［14］。

2 肠道菌群影响化疗

Paulos等［15］首次报道了肠道微生物群在肿瘤治疗中的有益作用，他们发现全身放疗可引起革兰阴性菌群的异位，并促进脂多糖的释放，从而诱导TLR4依赖的抗原呈递细胞的激活，进而可增强过继性T细胞疗法的疗效。此后，陆续有报道证明共生微生物在环磷酰胺和奥沙利铂等传统化学疗法中的有益作用。

环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）是一种DNA烷化剂，具有免疫调节作用和抗肿瘤血管生成的作用［16］。在使用CTX化疗后，在核苷酸结合寡聚化结构域2（nucleotide-binding oligomerization domain 2 ，NOD2）缺陷的小鼠中CTX的抗肿瘤活性显著增加，并发现小鼠近端结肠中革兰氏阴性细菌肠结巴斯德氏菌大量表达［17］。在NOD2缺陷小鼠中，发现小鼠脾脏和癌巢中Th1CD4+、CD8+和γδT细胞数量增加［18］。此外，还观察到在使用抗生素诱导小鼠肠道菌群失调的小鼠中，CTX的抗肿瘤活性被削弱，但在使用肠结巴斯德氏菌进行灌胃后，CTX的抗肿瘤活性恢复。相关临床研究发现，在对铂类药物耐药的非小细胞肺癌和卵巢癌患者中，对肠结巴斯德氏菌和小肠肠球菌具有特异性记忆IFNg反应的患者使用CTX治疗后，存活时间延长。

铂类抗癌药物，可通过形成铂-DNA加合物和链内交联来杀伤肿瘤细胞［19］。微生物群是促使肿瘤浸润骨髓细胞产生ROS不可缺少的一部分，而ROS是铂类化合物诱导DNA损伤所必需的。在无菌小鼠或使用广谱抗生素处理的小鼠中，观察到肿瘤细胞内仍可形成铂-DNA加合物，但铂类药物诱导肿瘤浸润性骨髓细胞产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）的功能受损，DNA损伤严重减弱，铂类药物的抗肿瘤作用明显下降［20］。而在用抗生素处理的小鼠中施用嗜酸乳杆菌后，恢复了顺铂的抗肿瘤活性［21］。有趣的是，嗜酸乳杆菌可以减轻放疗和顺铂在人体的肠道毒性，提示这种益生菌不仅可以增强抗肿瘤作用，还可以防止不良反应［21-22］。

3 肠道菌群影响免疫疗法

免疫疗法是癌症研究领域中最大的成功之一［23］。目前临床上最重要的两个免疫检查点靶点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTL4）和程序性死亡-1/程序性死亡配体-1（programmed cell-death 1/programmed death-ligand 1，PD-1/PDL-1）轴，相关抗体已被用于多种癌症治疗中。然而这些药物对大部分患者无效［24］。新的研究发现肠道微生物影响肿瘤与免疫系统的相互作用，且调节肠道微生物可改善免疫疗法的作用。

Ipilimumab是抗CTLA-4的单克隆抗体（mono-clonal antibodies，mAbs），CTLA-4可抑制 T 细胞活化，于2011年批准用于改善转移性黑素瘤患者的总体存活率［25］。在使用Ipilimumab之后，观察到小鼠回肠中脆弱拟杆菌富集，并且检测到脾内有抗脆弱拟杆菌荚膜多聚糖A的特异性记忆Th1细胞［26］。然而，在无菌小鼠或使用广谱抗生素处理的小鼠中［27］，Ipilimumab抗皮下肉瘤和结肠癌生长作用受损，而在使用脆弱拟杆菌灌胃或过继脆弱拟杆菌特异性CD4+T细胞后，恢复了Ipilimumab的抗肿瘤作用。此外，脆弱拟杆菌和洋葱伯克霍尔德菌联合进行灌胃，不仅增强了抗CTLA-4 mAbs的抗肿瘤作用，还防止了其诱导的肠道炎症和结肠炎［26］。通过分析转移性黑色素瘤患者使用Ipilimumab治疗前后肠道微生物的组成，鉴定了3种不同肠道微生物组成的患者，并将患者的粪便转移至植入黑色素瘤的无菌小鼠中，发现富含免疫原性拟杆菌属微生物的患者粪便可在抗CTLA-4 mAbs治疗过程中促进小鼠脆弱拟杆菌定植和扩增，并恢复了抗CTLA-4 mAbs在无菌小鼠中的抗肿瘤作用。以上实验表明抗CTLA-4 mAbs的抗肿瘤疗效部分依赖于脆弱拟杆菌。

抗PD1和抗PD-L1抗体通过阻止PD1在活化的T细胞上与在肿瘤细胞和其他基质细胞上表达的PD-L1结合，避免T细胞耗竭并维持T细胞功能，从而促进机体的抗肿瘤免疫功能［28］。Sivan等［29］发现抗PD-1和抗PD-L1 mAbs的抗肿瘤作用与小鼠中的双歧杆菌相关。他们比较了来自Taconic Farms（TAC）和Jackson Laboratory（JAX）两个实验室具有不同菌群的C57BL/6小鼠中B16.SIY黑色素瘤细胞的生长动力学，观察到TAC小鼠肿瘤较JAX更具侵袭性，且在JAX中发现肿瘤浸润CD8+T细胞的数量较TAC增多。而共同居住消除了这种差异，此外将JAX的粪便转移至JAC小鼠中，发现TAC小鼠的肿瘤特异性CD8+T细胞应答增强，抗PD-L1的疗效也得到增强。比较两者微生物组成发现JAX小鼠中双歧杆菌富集，而TAC小鼠口服长双歧杆菌和短双歧杆菌混合物后，植入的黑色素瘤的生长减缓，且促进了黑色素瘤特异性T细胞应答。

而近期发表在《Science》上的3篇论文进一步证明了肠道微生物群组成可调节抗PD-1和抗PD-L1免疫疗法在上皮肿瘤患者（包括非小细胞肺癌、肾细胞癌和黑色素瘤）中的疗效［30-32］。在这三项研究中，通过收集患者治疗前的粪便，根据患者的治疗效果将进行抗PD-1和PD-L1治疗的患者分为有应答者和无应答者，随后将粪便转移至无菌小鼠中，进行抗PD-1 mAbs治疗，这些小鼠再现了患者对抗PD-1 mAbs治疗的反应。在这些小鼠模型中，与接受无应答者粪便的小鼠相比，接受有应答者粪便的小鼠抗肿瘤免疫增强。尽管这些研究之间存在许多相似之处，但与应答者（相对于无应答者）患者相关的微生物物种仅部分重叠。在Routy等［30］和Matson等［32］的研究中，艾克曼菌在应答患者中明显富集。而在Gopalakrishnan等［31］的研究中，应答患者艾克曼菌也有富集，且发现瘤胃球菌科为黑色素瘤应答患者中的重要肠道菌属，而长双歧杆菌、产气柯林斯菌和屎肠球菌在Matson等［32的研究中更为重要［32］。

4 微生物干预作为癌症治疗方法

最近的研究提示可通过靶向作用肠道微生物群来提高肿瘤治疗疗效并减弱毒性和不良反应。例如，粪便微生物疗法越来越多地被用于治疗艰难梭状芽胞杆菌感染，其较传统抗生素治疗而言，不仅可改善患者的生活质量，还极大地节约了卫生成本［33］。然而粪便移植需要考虑多种因素，最重要的就是供体的选择。原则上，它应该具有不同微生物组成，且包含对治疗效果有利的细菌。但是微生物群除了可以调节免疫反应之外，还与慢性疾病相关［2］，一些细菌还在炎症诱导形成的癌症中发挥着作用。在进行粪便移植的过程中，还要考虑病原体转移，需要仔细筛选可能致病的细菌、病毒和寄生虫。

粪便微生物疗法是将共生菌群的混合物进行转移，其理想替代方法是单独或组合使用确定的细菌。这需要多种技术支持，包括精确鉴定和分离具有改善患者抗肿瘤免疫力的细菌，在体外进行扩增的培养条件，以及口服给药时保持细菌活性的封装方案。迄今为止，双歧杆菌、艾克曼菌、小肠肠球菌和拟杆菌属已在小鼠中被证明可改善抗肿瘤T细胞反应并增强药物的抗肿瘤的作用［17，26，29-30，32］。但考虑到人和小鼠肠道系统的差异，这些实验结果进入临床实验还需要进一步完善。此外，Matson等［32］根据对治疗有益细菌和不利细菌的比例来区分PD-1阻断免疫疗法后癌症患者应答者和无应答者，提示我们可以消除不利细菌以增强癌症患者免疫作用，但抗生素缺乏特异性且存在风险，所以需要更精确的用药方案。与抗生素相比，益生菌和益生元可能是改变肠道微生物群更精确的工具，其可促进特定细菌扩增，然而，益生元依赖于已经存在于宿主体内或可自然摄入的细菌。因此，控制患者间的异质性和实验变量可能是益生元药理学开发的一重要挑战。

5 结 语

在过去几年中，我们发现肠道微生物、肠道生理学、全身代谢、免疫系统和肿瘤疾病之间紧密相连。此外，由于技术飞速进步，包括改进的高通量微生物组测序技术以及精确的数据库；不断进步的培养遗传学使微生物群可培养及研究；质谱分析法和单细胞转录组学的进步可用于深入描述个体肠道系统、免疫系统及肿瘤细胞；荧光量子点标记技术用于实时监测肠道微生物［34］；适用于不同器官的高通量代谢组学；以及用于数据反卷积和集成的复杂生物信息学工具。这些方法学进展标志着我们通过实验探索单个细菌物种对肠屏障和机体免疫反应的作用已成为可能［35-36］。而越来越多的研究发现肠道微生物对外周免疫系统有着重要影响，并在抗癌免疫中可以诱发有效的抗肿瘤免疫监视作用，促进肿瘤微环境内树突状细胞活化和肿瘤特异性淋巴细胞增殖浸润，显着影响了小鼠和患者的癌症治疗效果。而相关技术的进步，可根据微生物的组成预测癌症患者对药物的疗效，并可通过粪便移植、特定细菌的移植或益生元等粪便微生物疗法改变患者肠道微生物组成，使肿瘤免疫抑制微环境转化为免疫刺激微环境，肠道微生物可作为癌症治疗的新型调节剂，实现精准化和个性化医疗。