嵌合抗原受体T细胞疗法治疗实体肿瘤的研究进展

李 涛，蒋 伟综述，季国忠，冯振卿审校

作者单位：210011南京，南京医科大学第二附属医院消化医学中心/肿瘤个体化医学协同创新中心[李 涛(医学硕士研究生)、蒋 伟、季国忠]；211166南京，南京医科大学基础医学院病(冯振卿)

0 引 言

近年来，以嵌合抗原受体T细胞疗法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）为代表的肿瘤免疫治疗取得了重大突破。CAR由能特异性识别肿瘤抗原的单链抗体序列（single-chain variable fragment，scFv）、胞内活化信号分子（通常为CD3ζ）和共刺激信号分子（通常为CD28、CD134或CD137等）组成。经过数年研究，CAR结构经历了五代发展。第一代CAR的胞内区仅含有CD3ζ，形成scFv-CD3ζ结构。由于缺乏共刺激信号，CAR-T细胞进入机体后会很快凋亡，抗肿瘤活性受到很大限制［1］。第二代CAR在细胞内区增加一个免疫共刺激信号分子CD28，形成scFv-CD28-CD3ζ结构。与第一代相比，第二代CAR-T细胞的抗原特异性不变，增殖和细胞因子分泌能力提高［2］。第三代CAR则是在细胞内区再增加一个免疫共刺激信号分子CD134或 CD137，形成 scFv-CD28-CD134-CD3ζ或scFv-CD28-CD137-CD3ζ结构。虽然有研究认为，第三代CAR比第二代更好，但目前这方面的证据仍不充分。第四代CAR（TRUCKs）除了嵌合抗原受体基因外，增加了具有免疫调节等功能的基因，从而提高CAR-T细胞的抗肿瘤活性［3］。第五代CAR为通用型，有望降低制备成本、简化制备程序［4］。

CAR-T细胞疗法特别是CD19 CAR-T细胞在治疗恶性血液系统疾病上取得了良好的临床疗效。2014年凯特琳癌症中心进行的CD19 CAR-T细胞靶向治疗B细胞急性淋巴细胞白血病的临床研究中，16例患者中有14例达到完全缓解（CR），完全缓解率达到88%［5］。2017年，美国诺华公司生产的针对B细胞前体急性淋巴性白血病的CAR-T细胞治疗药物Kymriah已通过FDA批准上市。截至2018年7月11日，已有92项CD19 CAR-T细胞靶向治疗血液病的临床实验正在进行，其中49项在中国。

目前针对CAR-T细胞治疗实体瘤的临床研究也在陆续开展，如抗HER2 CAR-T细胞治疗乳腺癌［6］，抗GPC3 CAR-T细胞治疗肝癌［7］等等。但由于实体肿瘤微环境比恶性血液病复杂，CAR-T细胞治疗实体肿瘤仍存在许多挑战，如CAR-T细胞低浸润性，肿瘤免疫抑制性微环境，脱靶效应等［8］。在实体肿瘤中，CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞首先要选择一个最佳的肿瘤抗原作为靶标，然后正确趋化浸润至肿瘤组织，克服低氧、低pH、低营养等恶劣因素以及肿瘤微环境内免疫抑制细胞及因子的影响，最后在其表达的CAR的“引导”下正确识别并结合肿瘤细胞，通过诱导细胞凋亡、裂解性杀伤等方式杀伤肿瘤细胞［9］。为了克服CAR-T细胞治疗实体肿瘤的局限，研究者们对CAR结构进行改进，以期通过优化CAR结构提高CAR-T细胞的疗效。

1 提高CAR-T细胞靶向性策略

CAR-T细胞免疫疗法最理想的靶抗原应仅在肿瘤组织高表达，在正常组织中不表达或呈极低表达状态［10］。目前应用于CAR-T疗法的实体肿瘤抗原多为肿瘤相关抗原（tumor associated antigen，TAA），这种抗原不仅表达于肿瘤细胞表面，在正常细胞也有一定程度的表达。所以靶向此类抗原的CAR-T细胞在杀伤肿瘤细胞的同时，往往会引发针对正常组织的on-target off tumor毒性，即“脱靶效应”［11］。

1.1 选择恰当的肿瘤相关抗原 多项研究已证实，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3，GPC3）在肝癌细胞表面高表达而在正常细胞上表达受限［12］，是一个很有前途的肝癌CAR-T细胞治疗靶点。GPC3 CART细胞对GPC3表达阳性的肝癌细胞展示出良好的活化和杀伤效果，而对不表达GPC3的肝癌细胞几乎无特异性杀伤作用［7］。黏蛋白MUC1是一种跨膜蛋白［13］，Wilkie等［14］进行的MUC1-CAR-T 细胞治疗MUC1过表达的乳腺癌实验证实，MUC1-CAR-T细胞可显著抑制乳腺癌小鼠模型移植瘤的生长。除了上述CAR-T细胞，靶向EGFR、CEA等肿瘤相关抗原的CAR-T细胞也已被证实具有良好的抑瘤效果［15-16］。

1.2 构建双特异性CAR 解决脱靶效应另一个常用方法为构建双特异性CAR。目前双特异性CAR存在如下3种设计方式。①靶向两种TAA的两个scFv分别与共刺激信号（CD28/CD137）和激活信号（CD3ζ）连接。其中一个scFv与CD28/CD137相连，另一个scFv与CD3ζ相连。这样只表达一种靶抗原的正常细胞与CAR-T细胞结合后，仅能提供激活信号或共刺激信号，无法充分活化T细胞。只有当CAR-T细胞遇到同时表达两种抗原的肿瘤细胞，CD3ζ激活信号和共刺激信号方可共同作用导致CAR-T细胞活化［17-18］。②两个scFv串联后与胞内区信号连接［19-20］。③一种scFv同时识别2种TAA。近期，李宗海团队研发出一种靶向EGFRvIII/EGFR的新型双特异性CAR-T细胞，这种CAR仅含有1个scFv片段，却能特异性地识别和结合胶质瘤细胞表面的EGFRvIII和EGFR位点，而对正常细胞表面的EGFR没有识别作用［21］。

2 促进CAR-T细胞肿瘤趋化能力

CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞首先要正确趋化至肿瘤组织，这一过程主要依赖于肿瘤细胞与T细胞之间的“趋化因子-趋化因子受体（chemokine receptor，CCR）”识别作用。但往往肿瘤细胞趋化因子表达水平降低，或T细胞缺乏相应的受体，导致CAR-T细胞很难“找到”这些肿瘤细胞。

2.1 T细胞过表达趋化因子受体 Craddock［22］等人在GD2 CAR-T细胞治疗神经母细胞瘤的研究中将CCL2受体CCR2b转导至CAR-T细胞，发现共表达GD2 CAR和CCR2b的T细胞可快速迁移至肿瘤部位，且CCR2b的表达不影响GD2 CAR-T细胞的杀伤功 能 。Moon［23］等 也 证 实 ，meso CAR-T 细 胞 表 达CCR2b后浸润能力提升12.5倍，meso CAR/CCR2b-T细胞和meso CAR-T细胞都可以抑制间皮素瘤生长，但meso CAR/CCR2b-T细胞的抑瘤效果更加明显。类似的还有通过过表达CCR4促进CD30 CAR-T细胞向霍奇金淋巴瘤细胞迁移［24］。

2.2 肿瘤细胞过表达趋化因子 除了T细胞过表达CCR，还有研究者试图通过促进肿瘤细胞表达趋化因子来增强CAR-T细胞迁移能力。Nishio［25］将趋化因子RANTES和细胞因子IL-15基因转导至溶瘤病毒Ad5△24内，联合应用Ad5△24和GD2 CAR-T细胞杀伤神经母细胞瘤。实验发现，溶瘤病毒特异性识别并入侵至肿瘤细胞后，一方面通过介导caspase-3活化促进肿瘤细胞凋亡，另一方面将其基因组整合至肿瘤细胞基因组中，促进肿瘤细胞表达RANTES和分泌IL-15。而RANTES的受体CCR1、CCR3和CCR5在T细胞表面普遍表达，因此GD2 CAR-T细胞可以被大量招募至肿瘤组织内，杀伤肿瘤细胞。同时肿瘤组织分泌的IL-15还可以促进CAR-T细胞在肿瘤微环境中的增殖及活化。由于正常组织缺乏相应的受体，Ad5△24不会杀伤正常组织细胞和T细胞。

3 促进CAR-T细胞抗肿瘤活性策略

不同于恶性血液病“简单”的肿瘤微环境，实体肿瘤微环境内免疫抑制性分子、细胞及T细胞自身的调节机制等因素都会对CAR-T细胞的活性和功能产生严重影响。

3.1 CAR-T细胞联合应用免疫抑制剂 程序性细胞死亡蛋白（programmed cell death protein 1，PD-1）主要在激活的T细胞和B细胞中表达，与PD-L1结合后发挥抑制性免疫调控作用，避免因T/B细胞过度激活而引起的自身免疫病。一些肿瘤细胞高表达PD-L1，导致PD-1/PD-L1信号通路被持续激活，抑制T细胞抗肿瘤免疫［26］。目前已研制出的PD-1/PDL1免疫检查点抑制剂，如PD-1阻断剂nivolumab、pembrolizumab，PD-L1 阻 断 剂 atezolizumab、durvalumab、avelumab，在黑色素瘤［27］、非小细胞肺癌［28］等恶性肿瘤中显示出良好的治疗效果。在一项HER2 CAR-T细胞联合PD-1抗体治疗乳腺癌的研究中，抗HER2 CAR-T细胞联用PD-1抗体杀伤肿瘤的效果强于单独使用CAR-T细胞或PD-1抗体。PD-1抗体与T细胞上的PD-1结合，不仅阻断了PD-1与肿瘤细胞表面PD-L1的结合，抑制PD-1/PD-L1信号通路对T细胞的免疫负调控作用，还会减少骨髓源性抑制性细胞CD11b+Gr-1+细胞的肿瘤浸润，间接减弱免疫抑制性因素对CAR-T细胞的影响［29］。

除了CAR-T细胞联合应用免疫检查点抑制剂，还有学者设计构建可分泌PD-L1单抗的CAR-T细胞［30］。CAR-T细胞到达肿瘤组织后，分泌的PDL1scFv可以与局部肿瘤细胞表面PD-L1结合，下调CAR-T细胞PD-1、LAG3、TIM3等免疫抑制分子的表达，并上调NK细胞的ACDD作用，即抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，多方面增强CAR-T细胞的抗肿瘤作用。而近期有报道称免疫检查点抑制剂疗法会引发严重的免疫性心肌炎［31-32］，该并发症目前没有有效的治疗手段，死亡率达46%［33］。这一不良反应将限制免疫检查点抑制剂在肿瘤免疫治疗中的应用。

还有研究者利用肿瘤细胞高表达PD-L1的特点，设计PD-L1反转受体，将PD-1细胞外区序列与CD28分子的跨膜区和胞内区序列相连，并与CAR基因序列一起转染至T细胞内。这样当CAR-T细胞与肿瘤细胞上的PD-L1结合后，将通过其胞内区的CD28分子产生活化信号而不是抑制性信号，并促进IL-2、IFN-γ等细胞因子的分泌，促进CAR-T细胞增殖、活化和肿瘤浸润［34］。

3.2 CAR-T细胞过表达细胞因子 CAR-T细胞在肿瘤微环境内除了要克服Treg细胞和PD-L1等细胞或因子的免疫抑制性调控作用外，还需要外源性生长因子维持生存。目前应用较多的为细胞因子IL-2、IL-12和IL-15等。IL-2半衰期较短，且全身性使用高剂量IL-2容易引发毛细血管渗漏综合征、器官衰竭等不良反应［35］。因此，有研究者设计将这些细胞因子基因转导至T细胞内，即第四代CAR。IL-2基因转导至T细胞后，激活的T细胞会自行分泌IL-2，维持T细胞的增殖和活化［36］。IL-12基因转导至T细胞后，可以招募NK细胞、重新激活TIL细胞、抑制IL-10、TGF-β等免疫抑制性因子分泌，改善肿瘤微环境［37］。

3.3 调控T细胞活化或凋亡相关基因表达 T细胞活化的第二信号DAG，在T细胞活化后会被甘油二酯激酶DGKα或DGKζ分解为磷脂酸［38］。若降低DGK表达，DAG将会被持续激活，促进T细胞活化和细胞因子分泌［39］。因此有学者设计了DGK敲除的DGK-/-CAR-T细胞，这种CAR-T细胞处于持续活化状态，对TGFβ、PGE2、腺苷等生长抑制因子敏感性降低，FasL、颗粒酶、穿孔素等肿瘤杀伤因子分泌增多［40］。

有研究表明，IL-2或IL-15缺乏所导致的T细胞凋亡往往伴随抗凋亡基因Bcl-2低表达，而过表达Bcl-2基因可以逆转生长因子缺乏所引起的细胞死亡［41］。在缺乏外源性IL-2因子支持的情况下，T细胞的活性仅能保持2周左右，而转导了Bcl-2基因的T细胞2周后仍能保持65%的细胞活性［42］。因此通过过表达Bcl-2延缓CAR-T细胞死亡，有望成为解决CAR-T细胞在肿瘤组织内生存的一条新途径。

除了上述改进手段，还有其他优化策略也在研究中。如引用自杀基因控制CAR-T细胞的副作用［43］，使用抑制性CAR（iCAR）减轻CAR-T细胞的脱靶效应［44］，采用瞬时转染方式减轻携带CAR基因的病毒对T细胞的毒性［45］等。

4 总结和展望

与手术治疗、放疗、化疗等传统的肿瘤治疗手段相比，CAR-T细胞通过激活机体免疫系统杀伤肿瘤细胞，展现出独特的优势和临床应用前景。但相对于它在治疗白血病方面取得的成就，CAR-T细胞对实体瘤的治疗远未达到人们所期望的效果。为了改善CAR-T细胞治疗实体瘤的效果，提高CAR-T细胞疗法的安全性，研究者们针对CAR结构开展了一系列优化和改进设计，并取得了一定的效果。而CAR-T细胞疗法涉及多方面因素，改善CAR结构只是其中一方面。提高CAR-T细胞对实体瘤的疗效还可以多角度进行探索，如选择肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）进行 CAR-T细胞制备，CAR-T细胞疗法与介入等其他疗法联用等。总之，随着免疫技术的不断发展，CAR-T细胞治疗实体瘤的临床应用是可以期待的。