长链非编码RNA在糖尿病视网膜病变发展及治疗中的研究进展△

郎海波 黄敏丽

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病性微血管病变中最为严重的并发症之一，也是16～64岁年龄阶段的主要致盲原因[1]。基于2853例糖尿病患者的研究发现，93%轻度和63%视力受威胁的DR患者并未关注自身眼部病变[2]，如若不能重视疾病进展给予及时干预，最终将走向失明。目前DR的治疗主要包括激光光凝术，玻璃体视网膜手术和阻断血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信号的治疗[3]，而调控靶向转录过程可能是一种新的方法。最近，非编码RNA的独立于蛋白质编码途径的调节活性受到广泛关注，长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)代表一类长于200个核苷酸的转录物，已经成为基因表达的新型监管者[4]。研究显示，lncRNA作为糖尿病并发症病理过程的重要调节因子，参与细胞增殖、细胞运动、免疫应答和炎症反应，这使得lncRNA基于RNA水平治疗DR成为可能[5-6]。

1 lncRNA的作用机制、表达及功能

Carninci等[7]在进行全基因组哺乳动物转录组分析时，揭示了一类新的转录本lncRNA，在基因组中广泛转录，在各种生物过程中扮演着关键的角色。目前已经发现超过200种疾病与lncRNA的功能失调相关，如心血管疾病、遗传疾病、神经疾病、免疫介导的疾病和癌症等均发现有lncRNA参与[8]。在肝细胞癌中微血管浸润相关的lncRNA-MVIH已被证明可以激活血管生成[9]，在发育期大鼠脑缺氧缺血损伤的病理过程中，lncRNA可能通过与 mRNA 相互作用的方式参与[10]。lncRNA的调节过程比较复杂，不仅参与mRNA相关转录翻译过程，还调控某些DNA、组蛋白甲基化过程，从而影响疾病发生发展[11]。顺式作用lncRNA沉默或激活位于同一染色体上基因的表达，而反式作用lncRNA影响其转录来源染色体基因以外的基因，并通过将蛋白质募集或使远离其转录靶位点来调节基因表达，进而参与多种成分间的相互作用[12]。lncRNA在对等位基因表达的表观遗传调节中也扮演着重要角色[13]。虽然lncRNA表达水平低，但具有高组织或细胞特异性模式，转录本可以形成具有明确功能特征的特定二级结构[14]。越来越多的证据表明，lncRNA通过改变基因表达模式对细胞状态进行重编程，在细胞分化、运动和凋亡中起到分子开关的作用[15-16]，参与不同疾病的发生发展。

2 lncRNA与DR

lncRNA通过调控多种信号通路参与DR的发病机制。Yan等[17]用微阵列分析链脲佐菌素(streptozocin，STZ)诱导的糖尿病小鼠视网膜中的lncRNA表达。研究发现早期DR的视网膜中约303个lncRNA异常表达，其中214个表达上调，89个表达下调。基因本体论(gene ontology，GO)分析表明，这些lncRNA共表达的mRNA主要针对眼睛发育的生物过程，在与细胞的膜组分整合过程中发挥分子活性。下面介绍一些与DR发生发展密切相关的lncRNA。

2.1 转移相关肺腺癌转录物1在加速DR疾病进展中的作用转移相关肺腺癌转录物1(metastasis-associated lung adenocarcinoma-transcript1，MALAT1)是一种高度保守的lncRNA，在肺癌、肝癌等多种肿瘤中高表达，也参与了DR的发病[17-19]。在STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜、糖尿病患者的房水样本和纤维血管膜以及高糖处理的RF/6A细胞中，MALAT1表达均显著上调，MALAT1敲低可通过改变p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPKs)的磷酸化水平，明显改善体内周细胞丢失、毛细血管变性、微血管渗漏和视网膜炎症[17-20]。在体内基因消融MALAT1可抑制内皮细胞的增殖，并减少新生儿视网膜血管化，在体外MALAT1可以调节视网膜血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成[21]。Puthanveetil等[22]还发现MALAT1通过激活血管内皮细胞(endothelial cell，EC)中的人血清淀粉样蛋白A3来上调肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)，参与高糖引起的炎症活化。MALAT1的高表达可以促进视网膜色素上皮增生和迁移、视网膜前膜形成，诱导视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)细胞间质转化，还在增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)的发生发展过程中发挥了非常重要的作用[23-24]。MALAT1体内基因消融已经突显了其在调控新生血管中的作用，相信经过深入研究，MALAT1有望成为评估DR预后的标志物以及基于RNA的靶向治疗药物。

2.2 lncRNA-ANRIL在DR致病中的促进作用INK4基因座的反义RNA——lncRNA-ANRIL(antisense non-coding RNA in the INK4 locus，lncRNA-ANRIL)一直是与动脉粥样硬化性心血管疾病和2型糖尿病明确相关的lncRNA。多项研究表明其通过顺式招募多梳抑制复合物PRC2诱导基因沉默，参与DR发生发展[25-26]。无论是高糖诱导的动物模型还是糖尿病患者的视网膜内皮细胞中均出现lncRNA-ANRIL明显上调，lncRNA-ANRIL通过对VEGF的调控来参与体外和体内DR的发生发展过程。Zhang等[27]研究表明，在糖尿病合并脑梗死大鼠体内过表达lncRNA-ANRIL，可以激活核因子-κB信号传导途径来上调VEGF，并促进血管生成。Thomas等[15]还发现，沉默lncRNA-ANRIL可以阻止高糖引起的VEGF过表达，这种调节涉及lncRNA-ANRIL介导的多梳抑制复合物PRC2的成分p300和miR200b的控制。在研究原发性开角型青光眼分子机制时，发现lncRNA-ANRIL还是早期视网膜神经节细胞凋亡的标记物[28]。检测和干预lncRNA-ANRIL可能在DR早期诊断和治疗中具有指导意义。

2.3 视网膜非编码RNA3在DR中的致病作用视网膜非编码RNA3 (retinal noncoding RNA3，RNCR3)最初被认为在小鼠视网膜发育期间表达，随后研究发现其在体内和体外高葡萄糖应激时也显著上调。Liu等[29]研究发现，敲低小鼠RNCR3基因不仅可以减少其视网膜内皮细胞增殖，减少RF/6A细胞迁移和血管形成，降低Müller胶质细胞的活力和增殖，而且可有效减轻糖尿病引起的视网膜微血管渗漏、视网膜神经变性和视网膜反应性胶质增生。RNCR3敲低导致IL-2、IL-3、VEGF和TNF等调控性因子的释放显著降低，通过RNCR3/ KLF2/ miR-185-5p调控网络调节内皮细胞功能，RNCR3/ miR-185-5p/ Chop调控网络抑制细胞外炎症和肿瘤相关信号的功能[30-31]。RNCR3敲低可能是预防糖尿病性视网膜神经变性很有前景的策略。

2.4 心肌梗死相关转录物在DR中的潜在治疗作用心肌梗死相关转录物(myocardial infarction-associated transcripts，MIAT)主要在细胞核中表达，并且在哺乳动物高度保守[3]，首先被认定为心肌梗死的易感性位点，后发现在调节哺乳动物视网膜细胞分裂中起关键作用[33]。在糖尿病大鼠的视网膜和增殖型糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患者的纤维血管膜中，MIAT表达显著上调；高糖条件下培养的RF/ 6A ECs、RPE、视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGC)和Müller细胞中，MIAT也同样表达增加，在其过表达时可介导miR-150-5p靶向调控减弱VEGF表达，减少视网膜新血管形成[6]。然而，MIAT敲低时可抑制TNF-α和细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)的上调，由此减轻血管渗漏和炎症，染色质免疫沉淀技术结果显示高糖促进核因子-κB和MIAT之间的结合活性，改变DR病变发展进程[5-34]，这显示了MIAT的调控作用具有复杂性。miR-29b敲低可以逆转抑制MIAT引起的效应，miR-29b可充当MIAT调节的生物标志物，并进一步调节DR中的细胞凋亡[1]。在DR不同阶段，MIAT组合式治疗可能会体现出特别的优势。

2.5 Sox2重叠转录物在DR治疗中的促进作用Sox2重叠转录物(Sox2 overlapping transcript，Sox2OT)是位于人类染色体3q26.33上lncRNA，Sox2OT的上调可以在多种类型的癌组织中观察到[35]。Li等[4]研究认为Sox2OT可作为视网膜神经功能的调节剂，在糖尿病小鼠的视网膜中和在高葡萄糖或氧化应激的RGC中，SOX2OT显著下调，Sox2OT敲低通过调节转录因子NF-E2相关因子2/血红素加氧酶1(即NRF2/ HO-1)信号活性发挥抗氧化作用，增加了NRF2和HO-1蛋白水平，并破坏了NRF2与Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch like ECH associated protein 1，KEAP1)之间的相互作用，调节NRF2蛋白的积累和核易位，对糖尿病导致的视神经变性发挥神经保护作用，逆转高糖诱导的细胞活力降低和细胞凋亡。

2.6 其他lncRNA在DR中的作用人类lncRNA母系印记基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)的DNA印记位点甲基化异常与2型糖尿病显著相关[36]。Qiu等[37]发现，lncRNA MEG3表达水平在STZ诱导的糖尿病小鼠的视网膜和高葡萄糖条件培养的内皮细胞中明显下调。MEG3敲低会介导磷酸化PI3k/ Akt信号传导的激活，虽然不影响任一蛋白质的总表达水平，但在糖尿病小鼠中会导致毛细血管形成、微血管渗漏和炎症蛋白质水平增加，加重视网膜血管功能障碍[8]。MEG3上调是否可能成为治疗DR靶向药物值得期待。

在DR早期，血浆脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)水平降低可能引起细胞凋亡和神经退行性病变，导致DR后期视网膜神经血管损伤[38]。高糖处理ARPE-19细胞时，BDNF显著下调，而反义脑源性神经营养因子(antisense brain derived neurotrophic factor，BDNF-AS)上调。SiRNA介导的BDNF-AS下调改善了ARPE-19细胞中高糖诱导的细胞凋亡和上调的BDNF。此外，抑制BDNF可逆转BDNF-AS下调对高糖诱导的细胞凋亡的保护作用[39]。低水平血BDNF和升高的IL-6可能是2型糖尿病DR的潜在危险因素，血浆BDNF水平≤12.4 μg·L-1是中国2型糖尿病患者DR和威胁视力的DR(vision-threatening diabetic retinopathy，VTDR)的独立标志物[40]。尽管与非DR患者相比，DR患者血BDNF水平上调和下调均有报道，但多数研究更倾向于BDNF下调学说。

日本学者通过大样本量人体三期全基因测序发现，RP1-90L14.1作为KIAA1009/ QN1/ CEP162基因相邻的长基因间非编码RNA，可能介导睫状体相关基因失调引发的DR易感性改变[41]。MALAT1和MIAT显著影响内皮细胞功能和DR，而lincRNA-p21控制新内膜形成[13]。

3 总结与展望

lncRNA的深入研究将激发DR的早期诊断和改进治疗新假设和新的临床应用。以上是目前被认可的与DR发病密切相关的lncRNA。不得不承认lncRNA作为有效的调控分子具有巨大的潜力，由于其细胞类型和疾病特异性表达，不仅可以作为DR生物标志物，而且可以成为DR的治疗靶点。

虽然有确凿的证据表明lncRNA参与了DR的发生发展，但lncRNA转录的广泛性和复杂性被严重低估，并且无数lncRNA与致癌作用有关[42]，lncRNA距离成为治疗DR的靶向药物还有很长的路要走，大多数lncRNA在生理学和疾病中以及作为治疗靶/分子的有效用途还需大量研究。