肝纤维化发生上皮—间叶质转化(EMT)的分子机制研究进展*

余亚平 陈芝芸 叶 蕾

浙江中医药大学附属第一医院，浙江省杭州市 310006

肝纤维化(Hepatic fibrosis)是多种原因引起的慢性肝损伤之后组织修复过程中的病理改变，是慢性肝炎转变为肝硬化过程的枢纽环节。其病理学基础是活化的肌成纤维样细胞(Myofibroblastic-like cell,MFLC)增多，细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)大量沉积。肝纤维化尚有逆转至正常的可能,故阻断和延缓肝纤维化的发展,是治疗慢性肝病的重要策略。

越来越多的证据表明[1]，间充质细胞在肝纤维化形成过程中起着重要的作用，而上皮—间叶质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)被认为是间充质细胞的重要来源之一。EMT即上皮细胞失去其上皮表型特征而逐渐获得间质细胞表型特征的过程。通过EMT，具有上皮表型的静止期HSC(Quiescent hepatic stellate cell，Q-HSC)、肝细胞、胆管上皮细胞以及窦状内皮细胞等可成为具有间质细胞表型的MFLC，并参与肝纤维化发生发展。但EMT是可逆的，即间质—上皮转化(MET)。EMT/MET 这两个可逆过程之间是否平衡是决定慢性肝病的进展、疗效及预后的重要因素。如果 EMT占优势则肝纤维化进展，反之，MET占优势则纤维化得到修复逆转[2]。

EMT的发生与多种蛋白分子、微环境及Micro-RNA等有关，涉及多个信号转导通路和复杂的分子机制，EMT在肝纤维化中的作用越来越受到重视，本文对EMT与肝纤维化相关的主要分子机制研究进行综述。

1 EMT的分子生物学机制

在EMT过程中，上皮标志物的紧密连接蛋白ZO-1、E-钙黏蛋白(E-cadherin)等表达下调；间质标志物的波形蛋白、β-连环蛋白(B-catenin)、α-平滑肌肌动蛋白、N-钙黏蛋白、成纤维细胞特异性蛋白1(FSP1)等表达上调[2]。

EMT的诱导因素众多：细胞外界刺激，如多种细胞因子和生长因子，缺血缺氧、炎症刺激等，其中生长因子在诱导肝纤维化EMT中发挥重要作用。多种细胞生长因子如过氧化物酶体增殖激活受体、肾素—血管紧张素—醛固酮系统的caspases、上皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、血管、内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β家族 (Transforming growth factor-βs，TGF-βs)等，与细胞膜特异性受体结合后均可触发细胞内信号级联反应，促使细胞发生EMT。

EMT的诱导过程受到核转录因子的调控。Snail、Twist、ZEB等各种转录因子往往通过不同的机制同时被激活，来抑制E-cadherin的表达。这些转录因子之间相互作用、相互调节，协同调控EMT的整个过程[3]。

2 肝纤维化中EMT的信号通路

2.1 TGF-β信号转导通路 TGF-β1是最重要的致肝纤维化因子[4]， Smads 是其主要信号转导途径。在各种损伤因子作用下，肝脏内 TGF-β1表达大量增加，与其Ⅰ、Ⅱ型受体绑定后引起Smad 2/3磷酸化；磷酸化的Smad结合体募集Smad 4并进入细胞核，调节ZEBl、ZEB2、Snail、Slug等转录因子，促进EMT发生。使用TGF-β1无血清培养基刺激原代小鼠/大鼠肝细胞后可见较多肝细胞死亡,细胞数量减少,形态由多边形向梭形转变，间质标志的α-SMA、N-钙黏蛋白、波形蛋白表达显著增加,上皮标志E-钙黏蛋白表达下降，且随TGF-β1浓度增加而呈剂量依赖性[5]。运用siRNA阻断TGF-β1信号通路可阻断了肝细胞的EMT现象。TGF-β1/Smad通路激活后可诱导胆管细胞、肝细胞以及肝卵圆细胞发生EMT，此通路可能是肝脏发生纤维化时诱导EMT的主要调控机制之一，几乎调控所有肝脏细胞发生转化。

TGF-β1还能通过活化丝裂原激活蛋白激酶，Rho家族的鸟苷三磷酸酶和磷脂酰肌醇3激酶促进EMT[6]。TGF-β还通过RhoA调节下游的Rho相关蛋白激酶(ROCK)、LIM Kinase(LIMK)和CoFILIN等，导致EMT，并可通过抑制LIMK阻断TGF-β通过基质细胞外基质蛋白层的侵袭，抑制Rho GTPases的活化则逆转EMT[7]。其他EMT转录调节因子如ZEBl，也受到TGF-β1-Smad方式的调节。

2.2 Notch信号通路 Notch信号转导通路由受体、配体、其他的效应物、CSL(一种DNA结合蛋白)、调节分子等组成。Notch与其配体Jaggedl结合后进入细胞内，在胞质内被释放出来，进入细胞核与CLS结合，调控EMT相关基因表达。Notch信号通路调控EMT过程主要是通过诱导Snail的表达来实现的，Snail蛋白也可以反过来调控Notch信号通路表达，进而在EMT过程中发挥重要的作用[8]。而Snail启动子的活化赖于TGF-β/Smad通路中Smad 3/Smad4的结合。Notch-1与TGF-β1在肝纤维化的发生过程中具有协同作用，两者均可能通过上调Snail基因抑制E-cadherin的表达进而启动EMT[9]。阻断 Notch信号能抑制TGF-β信号，抑制TGF-β信号也可阻断Notch信号。

Notch通路激活后，γ-分泌酶可以引发一系列的蛋白级联反应使Notch细胞内结构域(Notch intracellulardomain，NICD)活化[10]，活化后的 NICD进入细胞核内，可以使一些转录抑制因子转变为转录激活因子, 调控下游 EMT相关基因的表达。在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型中，通过γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号激活，可降低Snail、波形蛋白和TGF-β1的表达，同时增强E-钙黏蛋白的表达[11]。体外实验进一步发现，DAPT能抑制大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的EMT过程， Notch 2和Notch 3受体以及Hey2和HeyL靶基因的表达显著减少[8]。提示Notch信号转导与肝纤维化有关，DAPT治疗对肝细胞有保护作用，并改善肝纤维化。因此，抑制γ-分泌酶成为肝纤维化治疗的新希望之一。

2.3 Wnt信号通路 Wnt信号通路通过多条途径影响肝纤维化的发生发展，EMT是其中的重要途径之一。毕婉蓉等[5]研究表明Wnt信号通路参与了小鼠HF的过程,其机制可能是在实验性小鼠肝上皮细胞中通过下调内源的某些自分泌信号抑制因子,而诱导细胞启动EMT程序。经典的Wnt/β-catenin信号途径参与了E-钙黏素的调节以及EMT。Wnt 蛋白与Frizzled、LRP 相关受体结合,可抑制GSK-3β的活性从而影响了β-catenin 的磷酸化及降解[12]，促使β-catenin转移至细胞核内，与Tcf/Lef 结合，激活靶基因转录[13]，从而加速肝内细胞EMT以及纤维化的发展。

经典的Wnt通路还和其他通路相互作用。研究表明，TGF-β3通过上调Lef -1的活性诱发EMT，而TGF-β1能上调β-catenin/Lef-1。Lef 协同Smad3以及β-catenin从细胞质向细核内的转移在EMT中发挥了重要作用。Notch信号途径能明显上调经典Wnt信号途径的抑制剂-GSK-3β的活性，因此GSK-3β被认为是两条信号通路的一个重要结合点。除了TGF-β外，EGFR的胞浆部分能与β-catenin的核心区域紧密结合，降低E-cadherin/β-catenin复合物的稳定性，使E-cadherin介导的黏附功能下降。HGF、FGF等在体外诱导干细胞向肝系细胞方向分化，然后在分化中期(13d)、成熟期(17d)两个时间点动态抑制细胞Wnt/β-catenin信号以降低其EMT水平，可有效促进干细胞肝脏组织结构分化[14]。

Wnt 非经典信号通路较多，主要包括Wnt/Ca2+通路和细胞急性通路(Planar cell polarity pathway， PCP)。Tomonari等[15]研究发现pSTAT3表达与EMT和卷曲2(FZD2)状态显著相关，STAT3可能受Wnt5/FZD2和IL-6/JAK2信号通路的调控，在EMT中起重要作用。PCP通过激活 Dvl、小G 蛋白(Rho或者 Rac)等从而调节 JNK 信号来发挥作用。

Wnt 非经典通路与经典通路之间的相互关系却还不十分明确。有研究发现Wnt/β-catenin信号通路激活后，可上调大鼠HSC-T6细胞活性，但Wnt/β-catenin信号通路激活后，Wnt/Ca2+信号通路可能不受相关影响。在另外的研究中发现Wnt/Ca2+信号通路能够对Wnt/β-catenin通路起到抑制的作用。

2.4 Hedgehog(Hh)信号通路 Hh信号通路由 Hedgehog配体蛋白(Hh)、两个跨膜受体：Pmched(Ptc)和Smoothened(Smo) 、一些中间传递分子及下游转录因子Gli家族等构成。Hh通路的激活通过EMT调节纤维化发生[16]。NAFLD患者中表达EMT标志物的Shh生成细胞和Hh应答性导管细胞的数量与肝纤维化同时增加，Hh介导的EMT在NAFLD中参与了肝硬化的发病过程[17]。胆汁淤积性纤维化过程中胆上皮和基质的重塑，与过度激活Hh通路有关，添加Hh中和抗体共培养可阻断EMT和细胞迁移，避免向慢性胆汁淤积性纤维化的进展[18]。体外培养的HSC转变为肌成纤维细胞HH信号通路被激活,发生EMT及 Notch信号肽增加[16]。封闭肌成纤维细胞Notch信号, Hh通路激活受抑制,导致MET,抑制Hh通路而抑制 Notch 信号,诱导MET,因此Notch 和Hedgehog 通路相互作用控制着成熟肝修复中调控EMT/MET。

2.5 整合素信号通路 整合素表达增加与肝纤维化进展一致，其表达水平增加与HSC活化和血管新生有关，并与间质重建程度平行。整合素在诱导肝纤维化EMT的过程中涉及多种信号通路。整合素相关激酶(Integrin-linked kinase，ILK)和黏着斑激酶(Focal adhesion kinase，FAK)是其中的关键信号分子。

ILK活化后能磷酸化P13K/Akt信号通路中的Akt，经磷酸化作用及其他信号通路对ZEB、Snail、E-钙黏蛋白、NF-κB、β-catenin 、MMPs-9和细胞周期蛋白等多种EMT相关因子的表达进行调节。另外，P13K/Akt激活后，该通路的效应分子GSK-3失活，导致β-catenin泛素化失败，促使β-catenin转移至细胞核内，与Tcf/Lef 结合，激活Wnt/β-catenin通路。另有研究认为ILK可能是TGF-β1-Smad通路下游的效应因子，TGF-β1-Smad激活后，ILK的表达增加，导致E-钙黏蛋白的丢失和FN 的表达与聚积，阻断ILK则可逆转以上改变，并能部分抑制TGF-β1诱导的MMP-2表达，故认为阻断TGF-β1-Smad-ILK信号通路中的任一环节，可以控制肝纤维化的发生发展。

FAK是一种非受体酪氨酸激酶，在整合素介导的细胞信号中起关键作用。研究证明FAK控制EMT，E-钙粘蛋白、结缔组织血小板和细胞角蛋白的表达是该程序的重点[19]。FAK拯救通过细胞外信号相关激酶和Akt依赖的信号级联，并触发Snail1基因的表达。这些发现证实FAK是胚胎细胞中依赖Snail1的EMT的新的调节因子。整合素和ECM结合或细胞内的信号分子均可使FAK自身磷酸化，活化的FAK能够激活多条信号转导通路，包括Ras-Raf-MAPK/ERK、FAK-P13K/Akt及FAK-Wnt/β-catenin信号通路，TGF-β诱导的EMT也需要FAK信号转导。Patricio等[20]在细胞外基质调节肝细胞对成纤维细胞脱分化和转化生长因子β诱导的细胞凋亡的敏感性研究中，发展干燥的硬胶原通过Src激活FAK，导致Akt和细胞外信号调节激酶(ERK)1/2途径的激活。通过抑制Akt或Src，EMT可通过阻断ERK1/2通路而被废除。

3 小结

目前对于肝纤维化，因为欠缺有效的治疗手段，进而可能导致病情进展为肝硬化、肝功能衰竭，甚至肝癌，最终死亡。EMT靶向治疗为肝纤维化靶点治疗开辟了新的道路，其中EMT的逆转是关键。但EMT的发生涉及多个信号转导通路和复杂的分子机制。随着分子生物学技术的不断提高，参与肝纤维化形成的多种细胞因子及信号通路机制被逐渐阐明，这为开展分子靶向治疗提供了依据。但许多靶向治疗方法虽已被证实，但仍局限于动物实验中，未应用于临床治疗，且仍有一些信号传导通路机制尚未完全明了，有待今后更多的深入研究。