细胞铁死亡的分子调控机制及临床应用策略*

孙 杰 戴振航 沈义凯 彭 澜 吴艺舟

1 南京医科大学公共卫生学院，江苏省医药农药兽药安全性评价与研究中心，江苏省南京市 211166；2 南京医科大学第一临床医学院； 3 南京医科大学基础医学院细胞生物学系

细胞铁死亡(Ferroptosis)具有独特的形态特征、基因表达和严密的调控系统，是一种完全不同于凋亡、自噬和坏死的新型死亡模式。形态学特征主要表现在线粒体体积变小、双层膜更为致密、外膜破裂、嵴减少。生化特征主要表现在铁和活性氧的积累、蛋白激酶活化、胱氨酸/谷氨酸逆转运体(Cystine/glutamate antiporter system，System Xc)被抑制、胱氨酸摄取量减少、谷胱甘肽(GSH)合成减少、NAPDH被氧化等[1-3]。铁死亡信号通路中最重要的是铁离子和活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的产生。其中，ROS将铁死亡分成上游ROS的产生和下游ROS发挥作用执行铁死亡两个部分。本文将从ROS和铁含量的变化两个方面具体阐述铁死亡的发生机制。

1 ROS积累调控铁死亡

正常生理状态下，细胞中存在着谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidases，GPXs)能够催化过氧化氢和氢过氧化物的分解，将其转化为H2O和相应的醇，这一过程必须有谷胱甘肽(GSH)作为必要的辅助因子进行参与。GPXs家族包括GPX1～GPX8多个成员，其中GPX4在铁死亡的进程中有着更为重要的作用[4]。如果GPX4活性或表达量降低，将导致细胞内ROS含量积累升高，诱发铁死亡。在GPX4活性中心中有一种名为硒代半胱氨酸(Selenocysteine，Sec)的氨基酸，其需要Sec tRNA的转运才能进入到GPX4中发挥作用。而Sec tRNA的成熟需要异戊烯基转移酶(Isopentenyl transferase)将异戊烯焦磷酸(IPP)中的异戊烯基转移到Sec tRNA。因此可以通过IPP的形成途径即甲羟戊酸通路，调节IPP的产量，进而调节GPX4的活性，诱导铁死亡的发生。此外，小分子化合物RSL3对BJeLR细胞的诱导实验发现GPX4是RSL3的靶蛋白，RSL3通过直接作用于GPX4从而造成ROS的累积诱发铁死亡[5]。此外，其他的一些化合物如DPI7、DPI10等同样可以直接作用于GPX4，具体机制有待研究。

由于GSH是GPXs进行抗氧化反应必需的辅助因子，对GSH合成的调节也是铁死亡中重要的机制。GSH是由细胞内的甘氨酸、谷氨酸与胱氨酸共同合成，其中胱氨酸来源是关键。目前已研究证实有以下几种，第一种方式：调节System Xc。System Xc是在神经细胞膜表面广泛分布的氨基酸逆向转运体，将谷氨酸转移到胞外并将胱氨酸转入胞内。 因此System Xc对胱氨酸的摄取可以影响到GSH的生成量，进而改变GPX4的活性。erastin、sulfasalazine等铁死亡诱导剂通过抑制System Xc减少胱氨酸的摄取，从而诱导铁死亡。System Xc是由SLC7A11和SLC3A2组成的异二聚体。研究发现SLC7A11是抑癌基因p53的新靶点，p53可以通过下调SLC7A11的表达进而抑制System Xc摄取胱氨酸合成GSH，致使GSH依赖性的GPXs活性降低，细胞抗氧化能力降低，活性氧升高，引起细胞铁死亡[4]。第二种方式：调节β-巯基乙醇。β-巯基乙醇可以不通过System Xc促进胱氨酸的吸收，因此也是一条作用于GSH含量的铁死亡通路。第三种方式：调节氧化应激状态或者甲硫氨酸。胱氨酸的来源除上述两种以外，还存在着一种细胞氧化应激状态下的转化。在细胞氧化应激状态下，甲硫氨酸可以通过硫转移途径转化为胱氨酸，从而促进GSH形成及GPXs活性的增强。

以外，在缺血的神经组织中5-脂氧酶(5-lipoxygenase，5-LOX)表达明显升高。5-LOX是一个促进脂质ROS生成的物质，其抑制剂zileuton被证明能够抑制铁死亡从而保护神经组织[6]。 左旋谷氨酰胺是谷氨酰胺分解代谢过程中关键的中间产物，也被证实可以进一步诱导ROS生成并促进铁死亡。

2 铁累积调控铁死亡

铁是人体中必不可少的微量元素，在细胞的氧化、供能等方面都有着不可或缺的作用。铁离子在参与线粒体的氧化磷酸化过程中，细胞不仅仅会产生ATP，也会产生一定量的ROS。同时，细胞内二价铁离子的存在还可加速饱和脂肪酸的脂质过氧化过程。因此，细胞内铁摄入的增加和铁储存的减少都有可能造成细胞的铁过载，进而引发铁死亡。铜蓝蛋白(Ceruloplasmin，CP)和铁转运蛋白(Ferroportin，FPN)负责将细胞内铁离子向胞外输出。在蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage, SAH)后早期脑损伤中，CP和FPN可抑制铁向胞外转运，使得细胞内铁含量增加，进而诱发铁死亡。

二价金属离子转运体(Divalent metal transporter 1, DMT1)是铁代谢中向胞内转运铁的蛋白。三价铁离子可与转铁蛋白(transferrin)结合，从而转运到外周组织附近。可由细胞膜的转铁蛋白受体1(Transferrin receptor 1，TFR1)介导经胞吞作用进入细胞并储存于内体中，在酶促作用下被还原为二价铁离子，并被DMT1介导从内体中释放到细胞质中。铁蛋白(Ferritin)由铁蛋白轻链(FTL)和铁蛋白重链(FTH)构成，以多聚体形式吸收铁离子在胞质中储存。其中FTH含有亚铁氧化酶中心，将二价铁离子快速转化到三价铁并储存在铁蛋白分子中，FTL涉及铁的矿化和储存。研究发现抑制铁代谢的主要转录因子IREB2(Iron responsive element binding protein 2)可以显著增加FTL、FTH1的表达，表明通过IREB2可以间接调控体内铁离子吸收。此外，血红素加氧酶HO-1(heme oxygenase)也是细胞内铁的重要来源，研究证明HO-1可诱导脂质过氧化反应从而引起铁死亡的发生，还可以将细胞内的血红素分解为铁和卟啉，促进铁死亡的进程。当细胞内铁稳态被打破后，过量的铁通过Fenton反应将过氧化氢和脂质过氧化物转化为ROS，进而引起铁死亡。

3 铁死亡诱导剂

目前发现的铁死亡诱导剂包括调节氧化应激反应和调节铁离子代谢反应。(1)erastin是最先发现的铁死亡诱导剂。线粒体电压依赖性阴离子通道(Voltage-dependent anion channels，VDACs)是转运离子和代谢产物的跨膜通道[7]。erastin可以结合VDACs使得线粒体发生功能紊乱，产生ROS损害线粒体或直接作用于System Xc使其受到抑制，从而触发铁死亡，并且该过程由于HO-1诱导细胞内铁离子和产生ROS而得以增强。erastin的衍生物piperazine erastin因其在细胞内的溶解性及稳定性比erastin更优越，可通过诱导铁死亡抑制人成纤维肉瘤HT-1080细胞的增殖[8]。(2)索拉菲尼(sorafenib)现广泛应用于晚期肝癌的治疗中，可通过抑制System Xc诱导铁死亡的发生，从而增强对肝癌细胞的毒性，抑制其增殖，促进持续性的肿瘤衰退。研究发现核转录因子Nrf2可以调控GSH的生成量，通过激活p62-keap1-Nrf2通路可以实现抗氧化，防止细胞发生铁死亡。而敲除Nrf2及其靶基因可以增强sorafenib的活性，抑制肝癌细胞增殖。抑制p62后，HO-1、NQO1和FTH1的抗氧化反应元件可明显增强铁死亡诱导剂，如sorafenib、erastin、sulfasalazine等的活性[9]。(3)小分子化合物RSL3、DPI2/7/10和Fin56均可直接对GPX4产生抑制作用，从而产生脂质活性氧，导致铁死亡。诱导剂RSL5直接与VDAC2/3作用可以产生ROS导致铁死亡。丁磺氨酸(Buthionine sulfoximine，BSO)不可逆地抑制γ-谷氨酸/半胱氨酸合成酶的活性，从而减少GSH合成并抑制其活性。细胞外过量的谷氨酸或谷氨酸盐也能够抑制System Xc的活性，最终引起铁死亡[10]。(4)在乳腺癌的治疗过程中，西拉美新(siramesine)可以通过调控转铁蛋白的表达改变细胞内的铁含量，当造成铁累积时可以诱导铁死亡的发生。这一过程也可结合拉帕替尼(lapatinib)共同作用[11]。

4 铁死亡抑制剂

调节细胞内铁代谢正常进行、提高GSH水平、提高GPX4活性、直接抑制ROS产生等都能抑制细胞铁死亡的发生。调节氧化应激类抑制剂，例如第一代铁死亡抑制剂Ferrostatin-1的活性依赖于芳香胺，通过特异性地抑制脂质活性氧反应产生的ROS积累进而抑制erastin和RSL3诱导的铁死亡[12]。第二代(SRS11-92)和第三代铁死亡抑制剂(SRS16-86)的代谢更为稳定，且抗组织损伤的能力显著增强。如前所述，通过上调Nrf2表达量或利用zileuton抑制5-LOX活性降低ROS产生，均可以抑制铁死亡。对于神经细胞尤其是皮层神经细胞，酪氨酸激酶受体FLT3和PI3Kα抑制剂可抑制铁死亡的发生[13]。此外，trolox、ebselen、 tocopherol、vitamin E、lostoxin A、pepstatin methyl ester、丁羟甲苯、氯化铵等均可通过抑制脂质过氧化途径抑制铁死亡。

调节铁离子代谢类抑制剂通过适当减少不正常的铁摄取过程可以有效抑制erastin诱发的铁死亡。例如HSPB1(Heat shock protein beta 1)在细胞内参与铁摄取过程，通过抑制热休克因子转录因子-1的表达可以影响HSPB1的表达，进而抑制erastin诱导的铁死亡[14]。通过shRNA下调TFR1同样可以抑制erastin诱导的铁死亡。铁螯合剂抑制铁死亡是因为细胞内铁无法向氧化物传递电子，进而抑制ROS的生成[12]。根据铁螯合剂作用机制将其分为三类：亲脂性铁螯合剂可穿过细胞膜并螯合细胞内游离铁，抑制脂质自由基的形成；铁螯合剂可直接作用于含有铁离子的酶，进而抑制脂质过氧化；没有膜通透性的铁螯合剂如去铁胺(Desferrioxamine B，DFO)等，通过细胞内吞作用截取细胞溶酶体中的铁离子，进而阻止脂质活性氧的生成。

5 铁死亡的临床应用策略

针对不同类型的疾病，适当的铁死亡诱导剂或抑制剂可以起到一定的治疗作用。一方面，在癌症治疗领域利用铁死亡诱导剂治疗肿瘤细胞将成为癌症治疗的一种新思路。铁死亡作为一种新型细胞程序性死亡模式，因其特殊的作用机制和信号通路能对肿瘤细胞进行清除，尤其是对放化疗、凋亡等死亡方式不敏感的肿瘤细胞更为重要。例如胰腺癌细胞耐受化疗药物诱导的凋亡，却对青蒿酯诱导的铁死亡敏感。双氢青蒿素可以诱导头颈部鳞状细胞癌发生铁死亡[15]。西拉美新、拉帕替尼可以诱导乳腺癌细胞铁死亡[11]。对乙酰氨基酚可以诱导肝癌细胞发生铁死亡[16]。

另一方面，已有研究证实铁死亡与许多神经疾病的发生发展有关。不同于肿瘤治疗，在神经治疗领域通过抑制铁死亡的发生可以保护神经细胞，进而抑制神经疾病的发生。例如帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种复杂的神经疾病，其特征为多巴胺能神经元缺失。转铁蛋白在神经细胞的铁运输过程中有重要作用，但在PD患者中发生异常，导致神经细胞内铁过量输入，造成胞内铁离子聚集。PD患者黑质中铁离子含量明显升高，进而可引起羟基自由基升高和多巴胺氧化，氧化环境的产生可对黑质中多巴胺能神经元造成损伤。转铁蛋白受体TFR2的突变可能通过降低铁离子的摄取进而保护神经[17]。研究表明铁死亡在PD发生的机制中可能与多巴胺能神经细胞有关。人源多巴胺能神经元细胞系LUHMES细胞对铁死亡十分敏感，erastin能够诱导明显的铁死亡特征[18]。这表明给予PD患者铁抑制剂可能是PD患者潜在的治疗手段。此外，在Huntington舞蹈病(Huntington’s disease，HD)的前期研究中发现患者体内谷氨酸盐、GSH和铁离子含量异常、脂质过氧化物积累和神经细胞非凋亡性死亡[3]。在HD大鼠纹状体离体脑片模型中转染具有致病性的外显子HttN90Q7，再给予铁死亡抑制剂Ferrostatin-1，能够通过抑制脂质过氧化，明显减轻离体脑片中神经细胞的死亡情况。以上研究表明，铁死亡在疾病发生进程中发挥作用，对铁死亡的抑制有利于疾病进程的延缓、病情的减弱。对于神经疾病而言，铁死亡抑制剂是基础研究与临床治疗的一个新的切入点，具有关键意义。

综上所述，目前的研究已经表明铁死亡在重大疾病的研究与治疗方面具有重要意义。对细胞铁死亡机制的进一步研究有助于临床肿瘤及神经疾病的治疗，有着巨大的发展潜力。对铁死亡机制及铁死亡诱导剂、铁死亡抑制剂的探索势必成为今后的研究重点。此外对于目前已广泛应用于临床的药物，如索拉菲尼等在铁死亡的新作用机制的进一步研究也将具有重要的基础和临床应用价值。