反义寡核苷酸治疗的分子影像技术进展

孔繁磊,刘思耘,张宝平,石 喻，赵相轩，赵周社,郭启勇※

(1.中国医科大学附属盛京医院放射科，沈阳 110004； 2.GE医疗系统集团(中国)，北京100176)

1998年RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用被提出后[1]，RNAi凭借其几乎可以沉默任何选定基因的潜能，使基因治疗向前跨越了一大步。小干扰RNA(small interfering RNAs,siRNA)是一种双链RNA分子，长度一般为21～23个核苷酸。在进入细胞后，siRNA依靠ATP供能，与一种被称为RNA诱导沉默复合体的多亚基蛋白结合，在RNA诱导沉默复合体携带下与其序列互补的信使RNA(messenger RNA,mRNA)相结合，抑制特定序列mRNA翻译或在核酸内切酶及核酸外切酶的作用下降解掉与其序列互补的mRNA片段，从而抑制特定基因的表达，这种基因治疗方式称为RNAi治疗或反义寡核苷酸治疗。

反义寡核苷酸治疗在许多疾病的治疗中具有巨大的潜力，目前研究主要集中在眼类疾病、病毒感染、炎性疾病、基因紊乱和肿瘤[2-5]。但反义寡核苷酸治疗药物在生物体内转运至靶点发挥作用过程中也面临许多障碍[6-7]，并且由于一些不可预期的不良反应，反义寡核苷酸治疗还面临着安全方面的考量[4,8-9]。目前包括光学成像、磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)、单光子发射计算机断层显像(singlephoton emission computed tomography,SPECT)、正电子发射计算机断层显像(positron emission tomography,PET)及超声成像等多种分子影像模式已经应用在反义寡核苷酸治疗相关的研究上，用于对反义寡核苷酸治疗的生物进程进行成像、描绘和定量，并对反义寡核苷酸治疗效果进行监测，帮助研究者进一步理解RNAi生物学进程和沉默机制，优化反义核苷酸治疗[10]。现就多种用于反义寡核苷酸治疗的分子影像技术的研究进展进行综述，旨在促进分子影像在反义寡核苷酸治疗方面的应用和临床转化。

1 光学显像

光学显像主要包括荧光显像和生物发光显像(bioluminescence imaging,BLI)。由于光学显像具有光学标记选择多、易于标记、无创、可多通道功能成像及全身实时显像优势，为反义寡核苷酸治疗的临床前期研究提供了最便捷的成像方法。并且光学显像凭借其出色的敏感性及低廉的价格成为小动物实验中实时监测siRNA转运的重要成像方法。

1.1荧光显像 在荧光成像中，小动物被特定波长的光照射，激发其原位标记的荧光显像剂，然后荧光显像剂发射的光被低温电耦合元件过滤和检测。由于激发和发射的光都是可见波波段的低能光子，相对于具有电离辐射的其他成像方法，其显像更安全。然而，同样也是因为可见光光子能量较低，组织成分的吸收也造成了荧光显像组织穿透性不足这一弊端，使其在实际应用中不能用于大型动物或人的深层组织显像。此外，由于光在组织中传播存在散射现象，易造成荧光图像模糊，且在活体光学显像实验中，存在着由天然的组织荧光团所发射的自体荧光，这些荧光信号可以覆盖荧光探针的信号，最终降低图像的信噪比[11]。因此，在反义寡核苷酸治疗的荧光活体成像研究中多采用近红外荧光。波长650～900 nm的近红外荧光有较深的组织穿透性，同时具有较少的组织吸收、散射和自体荧光干扰[12]。如由菁荧光染料5.5(cyanines dye 5.5,Cy5.5)标记的血管内皮生长因子siRNA与聚乙二醇通过二硫化合物连接，并与聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)形成微胶粒。通过观察Cy5.5可以了解载有血管内皮生长因子siRNA的微胶粒将siRNA转运进入前列腺癌细胞的过程。前列腺癌荷瘤小鼠注射此类微胶粒后，可以观察到Cy5.5标记的siRNA微胶粒在肿瘤和主要器官中的聚集[13]。除组织荧光染料外，量子点、碳点[14-15]、上转换纳米微粒等纳米材料由于具有较高的信号强度和良好的光稳定性，也可同样用于反义寡核苷酸治疗的光学成像。特别是肿瘤特异性的多功能siRNA-量子点复合物，一方面可以诱导表皮生长因子Ⅲ表达下调，这种效应可以干扰多种肿瘤细胞增殖；另一方面，肿瘤细胞对siRNA-量子点复合物的摄取可用于荧光显像[16]。与量子点相比，碳点有更好的生物兼容性、价格低廉且更容易制备，被认为是量子点良好的替代品。近年来，上转换纳米微粒作为新一代的生物冷光纳米探针在细胞的标记和光学显像方面得到了越来越多的关注。上转换纳米微粒具有穿透力强、低自发光背景、强抗光漂白等优势，凭借这些优势成为反义寡核苷酸治疗方面非常具有前景的光学显像方式[17]。

1.2BLI 相比于荧光成像，BLI不需要为活体生物提供外部光照，因为BLI是通过体内的荧光素在荧光素酶的催化下产生的氧化反应显像。许多荧光素酶基因都可以通过转染的方式进入生物系统，并表达相应的荧光素酶。BLI没有自体荧光的干扰，因此相对于外源荧光分子影像，BLI具有更高的灵敏度和信噪比。体外进行反义寡核苷酸治疗或者将产品直接注入动物模型后，可以通过检测生物发光产物或荧光蛋白(如绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白)来检测基因沉默效果。这将有助于在进行下一步人体试验前筛选最优的反义寡核苷酸治疗方法和最优的剂型。McCaffrey等[18]证明了使用BLI检测siRNA的转运和评估基因沉默效果的可行性。有学者通过BLI对反义寡核苷酸治疗的基因沉默的动力学进行了研究，用来筛选最好的基因沉默方法，同时基于体外荧光素酶的降低来模拟或预测siRNA有效剂量[19]。但由于BLI显像需要基因转染，这项技术在人体的应用受到了限制。

2 PET及SPECT

PET和SPECT是核素显像技术，在活体中通过使用放射性示踪剂以及检测γ射线从分子水平提供检测对象的分子特征信息，两种显像系统均有良好的组织穿透性和全身显像高敏感性的特点。通过被放射性探针标记的siRNA，可以无创地对相应反义寡核苷酸治疗药物的灌注、药动学和生物学分布进行评估。PET及SPECT具有实时活体显像的优势，并且对于同一动物可以在不同时间点进行研究，相对于传统方法减少了实验动物的用量。

2.1PET 用于PET的放射性同位素由于原子核的不稳定性经过β plus(β+)衰变，基于正电子湮灭产生了两个方向相反的γ射线，通过γ相机监测，提供了感兴趣区域角度和距离的信息，这使PET具有高敏感性和重建定量断层图像的优势。PET在反义寡核苷酸治疗中被用于研究药动学和药物生物学分布。在反义寡核苷酸治疗中，PET显像剂有两种标记方法：一种是标记siRNA本身，这种方法可能会影响siRNA的功能、特异性或反义寡核苷酸治疗的效果；另一种是标记siRNA载体，这种方法不会影响siRNA的有效性，但是图像数据代表的是载体而不是siRNA的位置信息[20]。18F(t1/2=109.8 min)和64Cu(t1/2=12.7 h)等短半衰期同位素经常在PET中被用作标记siRNA分子或其载体系统的放射性示踪剂。对于PET来说，为了对特定的器官和组织特异性显像,需要研发特殊的放射性示踪剂。在一项研究中[21]，镂空壳体结构的黄金纳米微球被设计成为siRNA转染载体系统，用于转染B细胞核因子κ轻链增强子的siRNA。通过将1,4,7,10-轮环藤宁-1,4,7,10-乙底酸的衍生物结合在纳米微球表面，并用64Cu标记进行显像。在宫颈癌荷瘤裸鼠静脉注射药物后，PET/CT图像显示靶向的黄金纳米微球在肿瘤中的集聚明显高于非靶向的黄金纳米微球。在18F标记的siRNA研究中[22]，用氟原子或甲氧基基团替换掉siRNA序列的特定核苷酸的2′羟基基团，最终结果显示反义寡核苷酸治疗效果相似。在啮齿类动物静脉注射18F标记的siRNA(氟或甲氧基修饰或者不修饰)后行PET检查，图像显示放射性物质迅速被肾脏和肝脏清除，尽管siRNA的组织分布相似，但氟修饰的siRNA与甲氧基修饰和不修饰的siRNA相比有更持久的血液浓度和稳定性。Hatanaka等[23]运用N-琥珀酰亚胺-4-18F-氟苯甲酸标记siRNA进行实时显像研究siRNA的转运，PET图像显示18F标记的“裸”siRNA在血液中被迅速清除并从肾脏排泄，然而18F标记的siRNA与阳离子脂质体复合物倾向于在肺内集聚。现在对于反义寡核苷酸治疗的PET来说，需要针对不同目的开发新的特异性显像剂实现特异性显像。更重要的是，迫切需要一种简单高效的18F标记siRNA方法，因为已有的传统方法不仅耗时长且产量低[24]。

2.2SPECT 与PET相似，SPECT是利用放射性同位素发射出单个γ射线进行显像。相比而言，因为SPECT不需要回旋加速器制作短半衰期放射性同位素，所以SPECT价格明显低于PET[25]。SPECT使用长半衰期的同位素或通过发生器洗脱得到的同位素，如111In(t1/2=2.8 d)、99Tcm(t1/2=6 h)、123I(t1/2=13.3 h)和131I(t1/2=8 d)在活体器官中通过观察放射性分布和代谢来提供局部的功能信息。Liu等[26]用一种99Tcm的螯合剂HYNIC(hydrazinonicotinamide)修饰siRNA，通过γ射线计数和微量自动射线照射技术，在细胞水平监测siRNA，同时，通过荷瘤小鼠的全身显像来研究siRNA的转运过程和生物学分布。Merkel等[27]同样也使用了SPECT监测发射γ射线的放射性同位素(如111In/99Tcm)标记的siRNA的生物学分布和药动学情况。在实时灌注显像的研究中，通过标记的放射性同位素发射的γ射线可以看到siRNA迅速在肝脏和肾脏集聚，通过闪烁计数定量感兴趣区的siRNA，结果显示，siRNA在血池的半衰期短于3 min，迅速排入膀胱。SPECT使用的γ光子无法提供足够的空间信息进行断层重建，因此SPECT需要设计特定仪器进行数据采集，并且SPECT的敏感性比PET低一个数量级[25]。

3 MRI

MRI是一个应用非常广泛的技术，MRI具有高空间分辨力，深部组织穿透性及良好的软组织对比度的特点。在临床上已经被广泛应用于解剖学和组织的功能的研究。可以同时用于显像和siRNA转运的MRI对比剂研发，是现在RNAi分子影像研究的热点之一。对比剂根据磁共振特性和弛豫机制可以分为T1对比剂和T2对比剂。超顺磁性氧化铁纳米微粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)可以在T2加权成像时降低特定组织的自旋弛豫时间，属于T2对比剂的一种，目前临床上有许多种SPIONs可以选择。Mok等[28]基于SPIONs设计合成了一种对pH敏感的装载有siRNA的纳米微粒，这种纳米微粒是常用于siRNA转染的大分子对SPIONs修饰而成，并在表面涂有抗绿色荧光蛋白siRNA和肿瘤特异性配体(氯霉素)。与现在市场上常见的T2对比剂相比，该纳米微粒对图像对比度提升更明显。更有趣的是在pH为7.4时，该纳米粒子并不会引发明显的细胞毒性，然而在pH为6.2时由于酸性环境的诱导，通过伯胺的质子化作用会产生明显的细胞毒性。同时，由于在pH为7.4时该纳米粒子表面的负电荷是在pH为6.2时的3倍，进入细胞更加困难，因此在酸性环境下siRNA基因沉默效果明显高于在正常生理环境中的效果。在另一项研究中[29]，在表面涂有聚乙二醇-PEI复合物的SPIONs上，进一步通过针对双唾液酸神经节苷脂CD2的单链抗体片段进行修饰，合成一种新的纳米微粒。该纳米微粒可以将Bcl-2 siRNA带入肿瘤细胞,不仅可以沉默Bcl-2 mRNA表达，同时还可以用MRI对siRNA转染效果进行确定。除了T2增强对比剂，顺磁性物质，如钆剂、锰剂等可以通过减少T1弛豫时间来提升T1信号强度，被广泛应用为T1增强对比剂。在Bae等[30]的研究中，使用镂空氧化锰纳米微粒作为一体化的纳米载体，同时对肿瘤进行siRNA的转染和MRI。镂空氧化锰纳米微粒与结合有分支状PEI的3，4-二羟基左旋苯丙氨酸依靠3,4-二羟基左旋苯丙氨酸和金属氧化物之间的强亲和力连接，这个复合物进一步通过赫塞汀(靶点为表达表皮生长因子受体2的癌症细胞的单克隆抗体)修饰。近年来，T1～T2双模态增强对比剂的发展受到越来越多的关注，因为它可以同时为高组织分辨率的T1加权和高病变检出率的T2加权提供对比。Wang等[31]报道了低分子量PEI包裹和钆剂嵌入的氧化铁纳米团簇用于siRNA转染T1～T2双模态MRI，在双模MRI引导的siRNA转染过程中，钆剂嵌入的氧化铁-低分子量PEI包裹表现出了在MRI测量中的良好的弛豫改变特性和绿色荧光蛋白表达中的抑制性。

4 超 声

超声在临床上非常普及，具有高空间、时间分辨率的特点，且价格低廉。超声对比剂对于提高超声图像病变对比度非常重要，一些对比剂已经用于临床与科研，如微泡、纳米微滴、纳米微泡和脂质体[32-34]，这些对比剂表面通常有蛋白、多肽、脂质或表面活性剂来保持其在血液中的稳定性，同时用来摆脱单核吞噬细胞系统的清除。对比剂中荷有空气或生物学的惰性气体来增强回声，另外，一些腔隙中存有气体的固体纳米微粒或由可以产生气体材料组成的纳米微粒也已经用来增强超声图像的对比度[35]。

超声在反义寡核苷酸治疗中具有潜在的优势。siRNA分子可以通过连接于微气泡的表面、包裹在脂质双分子层中等方式与超声对比剂结合，制作超声探针。在低声压条件下(<100 kPa)，当超声探针到达肿瘤的血管时，超声可以用于反义寡核苷酸治疗的疾病诊断和监测治疗效果；在高声压条件下(>100 kPa)超声可以用于破坏超声探针，在指定位置释放探针装载的“货物”(药品或RNAi)，同时还可以改变特定区域细胞膜的通透性，使更多的siRNA进入细胞，实现更好的基因沉默效果，因此超声可以提高反义寡核苷酸治疗的效果[33,36]。如Carson等[37]将定向表皮生长因子受体的siRNA连接于微气泡表面，每109微气泡可以运载7 g的siRNA,并且可以保护其中的siRNA不被RNA水解酶消化。实验证明装载有表皮生长因子受体-siRNA的微气泡在体外可以降低鼠类鳞癌细胞表皮生长因子受体的表达；在活体试验中，超声在特定肿瘤区域诱发的微气泡破裂释放siRNA可以有效地延缓肿瘤的生长，同时可以通过超声监测肿瘤体积。相比于微气泡，小体积的超声探针，如纳米气泡、纳米粒子，纳米脂质体等有更好的组织穿透性，可以更好地在病变组织中聚集，在病灶的诊断和超声引导的反义寡核苷酸治疗方面有更好的效果[34,38]。另外，超声探针可以同时装载多种物质，实现不同功能，如抗癌药物和DNA质粒可以同时装载于超声探针，在进行肿瘤成像同时实现肿瘤联合治疗[32]。

5 小 结

分子影像技术进展为反义寡核苷酸治疗的成像和量化提供了新方法，并且有助于研究者进一步理解RNAi生物学进程和沉默机制。在分子影像的帮助下，将临床前期研究中的成果向临床转化非常重要。目前，许多成像方式(如光学、PET/SPECT、MRI和超声成像)已经用于评估siRNA的转染、确定其生物学分布及监测治疗效果。对于反义寡核苷酸治疗的进展，特别是临床前期研究的进展发挥了重要作用。尽管每一个成像方式都有其独特的优势，但同样每一种成像方式也有其固有的缺陷，因此无法通过单一的成像方式获得靶器官结构和功能等各个方面的准确、可靠的信息。为了更好地追踪标记的siRNA、转运载体，更准确地评估治疗效果，多模态成像成为未来发展的趋势[39]。然而，在发展多模探针的发展过程中，特别是多模探针在活体中的应用还存在着一些挑战：可能面临单核吞噬细胞系统的吞噬造成的目标区域探针无法聚集；探针清除缓慢，长时间滞留在组织和器官中，具有长期的细胞毒性。另外，不同的显像模式在敏感度方面差异巨大，因此将两种探针结合在一起需要前期全面仔细的设计。合理设计的分子成像探针对于精准地监控反义寡核苷酸治疗的生物学进程、全面地认识其在疾病治疗中的潜能、帮助反义寡核苷酸治疗进行临床转化至关重要。