金属β内酰胺酶及其抑制剂的研究进展

鞠林成，史亚兴，苗东旭，殷 波,宋永胜

(中国医科大学附属盛京医院泌尿外科，沈阳 110004)

细菌感染是临床中十分常见的感染性疾病。患者一旦发生细菌感染，往往使其住院时间延长、医疗支出增加，尤其是医院获得性感染可以增加患者病死率[1]。临床中针对细菌感染最重要的策略是给予患者抗生素治疗，青霉素(一种β内酰胺类抗生素)是最早在临床中大规模使用的抗菌药物，目前临床中的β内酰胺类包括青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和单环β内酰胺类。随着制药工业的不断改进，β内酰胺类具有血药浓度高、抗菌谱广和毒性低的抗菌特点，是目前全球范围内应用最广、使用率最高的一类抗生素[2]。文献报道，在所有种类的抗菌药物中，β内酰胺类在美国的使用率已经超过65%[3]。β内酰胺类可以靶向作用于一种位于细菌细胞壁上的关键酶——转肽酶，并通过共价结合的形式与转肽酶的活性位点结合，降低细菌细胞壁的机械强度，限制细菌细胞壁合成[4]，而且该类抗生素还可以通过共价修饰的方式抑制细菌细胞壁聚肽糖层合成的关键酶——青霉素结合蛋白，使得细菌细胞壁完整性缺失，最终导致细菌细胞溶解[5]。但与临床中应用的其他种类抗菌药物所面临的情况相同，随着β内酰胺类的过度使用，临床中的主要致病菌(如革兰阴性菌中的肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌，以及革兰阳性菌中的肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌)不断出现耐药菌株并在全球范围内迅速播散，使β内酰胺类这一有效的抗菌武器正在失去效力，细菌耐药已成为临床中不容忽视的严重问题。细菌对β内酰胺类的耐药机制可以分为4种：细菌以主动泵出的形式将进入细胞内的药物泵出细胞外；降低外膜渗透性减少抗生素进入细胞内；细菌通过自身突变或产生某种酶修饰抗生素的作用靶点导致靶点的结构发生变化进而使药物作用降低或无法发挥作用；表达β内酰胺酶使抗生素失去活性[6]。而且细菌还会同时具有一种以上的耐药机制，且彼此之间产生协同作用，最终也可导致对抗生素的耐药[7]。临床中主要致病菌最重要的耐药机制是表达β内酰胺酶。β内酰胺酶是一种水解酶，可以催化水解β内酰胺类抗生素的特征性四元环，进而使β内酰胺类结构发生改变产生无效产物，最终导致该类抗生素失去抗菌活性。现就金属β内酰胺酶(metallo-β-lactamases，MBLs)及其抑制剂的研究进展进行综述。

1 β内酰胺酶的分类

目前文献报道的β内酰胺酶有2 000多种[8]，依据氨基酸序列的不同可将β内酰胺酶分为A、B、C和D四类[9]。其中A、C和D类依靠酶活性位点的丝氨酸表达催化活性，因此被称为丝氨酸β内酰胺酶(serine-β-lactamases，SBLs)。1940年，Abraham和Chain报道了第1例SBLs[10]，至今SBLs的数量已经超过了1 000种。在临床上，克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦、阿维巴坦这4类抑制剂可以抑制SBLs的催化活性，恢复β内酰胺类抗生素对细菌的抗菌活性[11]。因此,这些抑制剂与β内酰胺类抗生素构成的复合物可用来治疗表达SBLs细菌引起的感染性疾病。与A、C和D三类β内酰胺酶不同，B类β内酰胺酶依靠活性位点的1～2个Zn2+表达催化活性，因此被称为MBLs[9]。

2 MBLs的结构

MBLs之间的氨基酸序列同源性低，文献报道小于25%[12]。所有的MBLs都含有αβ/βα的特征性结构，即β折叠在内侧，α螺旋位于外侧。两个α螺旋与β折叠构成的结构域之间是酶的活性位点，活性位点有Zn2+结合。根据活性位点金属离子的个数以及活性位点金属离子结合氨基酸的不同，MBLs又可分为3个亚群：B1、B2和B3亚群[13]。B1和B3亚群MBLs活性位点有2个Zn2+，可以水解青霉素类、头孢菌素类及碳青霉烯类抗生素。B2亚群MBLs活性位点有1个Zn2+，专一水解碳青霉烯类抗生素。B1亚群MBLs的第1个Zn2+结合3个组氨酸并通过1个氢氧化物与第2个Zn2+连接，形成四面体配位结构；第2个Zn2+结合1个组氨酸、1个半胱氨酸、1个天冬氨酸和1个水分子，并由1个氢氧化物与第1个Zn2+连接，形成三角双锥体配位结构；B2亚群MBLs活性位点的Zn2+结合1个组氨酸、1个半胱氨酸和1个天冬氨酸；B3亚群与B1亚群结构类似，不同之处在于第2个Zn2+结合2个组氨酸和1个天冬氨酸。

3 MBLs与临床感染的相关性

B1亚群MBLs数量最多且大部分与临床有相关性，如在多种革兰阴性致病菌中发现的亚胺培南酶(imipenemases，IMPs)、维罗那亚胺培南酶(Verona imipenemases，VIMs)和新德里金属β内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamases，NDMs)，以及在铜绿假单胞菌中发现的巴圣保罗金属β内酰胺酶1(São Paulo metallo-β-lactamases 1,SPM-1)、蜡样芽孢杆菌中发现的β内酰胺酶Ⅱ、脆弱拟杆菌中发现的耐碳青霉烯和头孢菌素酶以及脑膜炎脓毒菌中发现的β内酰胺酶B。B2亚群MBLs数量最少，包括嗜水气单胞菌中发现可以水解碳青霉烯类的MBLs、维氏气单胞菌中发现的亚胺培南酶和居泉沙雷菌中发现对碳青霉烯类耐药的MBLs。B3亚群MBLs多存在于机会致病菌中，主要包括嗜麦芽窄食单胞菌中发现的L1型MBLs和戈尔曼军团菌中发现的MBLs[12,14]。

1966年(大约在SBLs发现的25年后)，Sabath和Abraham[15]首次在一种名为蜡样芽孢杆菌的非致病菌中发现了一种含有金属锌并且可以被乙二胺四乙酸(一种金属离子的螯合剂)抑制的β内酰胺酶。在此之后的20年中，由于发现的MBLs主要存在于非致病菌中，没有造成严重的临床问题，因此MBLs并没有引起足够的关注。随着时间的推移，研究发现MBLs可以由染色体编码在多种细菌中传播，如脆弱拟杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、产气单胞菌以及金黄杆菌属，而且在肠杆菌属、铜绿假单胞菌、黏质沙雷菌及不动杆菌属致病菌中还发现了质粒介导的MBLs耐药基因[14]。重要的是，除单环β内酰胺类抗生素外，MBLs可以水解包括碳青霉烯类在内的其他所有的β内酰胺类抗生素[16]。与SBLs不同，目前临床上还没有任何一种针对MBLs的抑制剂可以抑制MBLs的活性。MBLs耐药基因在细菌中传播使其成为“超级细菌”，导致临床上的抗生素失去效力，使越来越多的细菌感染性疾病无药可用。其中播散程度最为广泛、与临床关系最为密切的是IMPs、VIMs和NDMs[12]。

1991年，日本学者在铜绿假单胞菌中发现了一种可以水解亚胺培南的β内酰胺酶，即IMP-1[17]。目前美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)有73个IMPs的变异型，IMPs主要在日本流行。VIM-1是在意大利维罗那发现并于1999年被报道的[18]，NCBI可查到56个VIMs的变异型，VIMs主要在欧洲流行。

NDM-1最早报道于2009年，1例由印度新德里返回瑞典的患者患有泌尿系感染，其尿液中发现了耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌菌株，该菌株携带NDM-1基因[19]，目前NCBI上报道了21个NDMs变异型。虽然NDM-1比IMP-1和VIM-1出现的较晚，但是其播散呈全球趋势且不受地域限制，而且在假单胞菌属、肠杆菌属和不动杆菌属等多种革兰阴性菌中均发现了NDM-1[20]。新近研究显示，NDM的临床变异型在Zn2+浓度较低的情况下仍然具有生物活性[21-22]。

4 MBLs抑制剂

美国疾病控制与预防中心于2017年1月报道了1例感染了耐碳青霉烯肠杆菌的患者，该患者感染了产NDM-1的肺炎克雷伯菌。药敏试验显示该细菌对26抗生素耐药，包括氨基糖苷类抗生素及多黏菌素，而且对替加环素亦不敏感，最终该患者死于细菌感染[23]。

在所有引起院内感染的致病菌中，对人类健康威胁最大的是被称为ESKAPE的这一类病原体，即E(Enterococcusfaecium，屎肠球菌)、S(Staphylococcusaureus，金黄色葡萄球菌)、K(Klebsiellapneumoniae，肺炎克雷伯菌)、A(Acinetobacterbaumanii，鲍曼不动杆菌)、P(Pseudomonasaeruginosa，铜绿假单胞菌)及E(Enterobacter，肠杆菌)[24]。表达NDM-1的ESKAPE病原体可以抵抗具有“终极手段”之称的碳青霉烯类药物，消除此类素抗生素的抗菌活性[25]。表达MBLs的细菌感染已成为临床中越来越突出的问题[26]，而且针对SBLs的抑制剂对MBLs无效[27]，目前临床上没有药物可以治疗表达MBLs的细菌引起的感染性疾病。因此，临床上急需有效的抑制剂来解决MBLs介导的细菌耐药问题。目前抑制剂研究的普遍策略是通过与MBLs活性位点的Zn2+发生作用，从而抑制MBLs的催化活性，进而恢复β内酰胺类抗生素的抗菌活性。鉴于B1亚群与临床关系最为密切且尤以其中的IMPs、VIMs与NDMs突出，在此列举一些与该类MBLs相关的抑制剂。

4.1金属螯合剂 移除MBLs中的Zn2+可以抑制MBLs活性。乙二胺四乙酸及吡啶二羧酸即属于该类抑制剂[16]。King等[28]报道了一种名为曲霉明A(aspergillomarasmine A，AMA)的抑制剂，该抑制剂来源于真菌的天然产物。体外实验中，AMA可以有效抑制NDM-1及VIM-2的活性，与美罗培南联合可以起到协同作用，提高美罗培南抗肠杆菌属、假单胞菌属和不动杆菌属的抗菌活性。在产NDM-1的肺炎克雷伯菌感染的小鼠动物模型中，AMA也可以提高美罗培南的抗菌活性。后续的研究也证实了AMA通过移除NDM-1及VIM-2活性位点的金属离子对其产生抑制作用[29]。由于人体内有多种蛋白质需要相应的金属离子来维持生物活性，应用该类抑制剂的同时会不可避免地影响这些含有金属离子的蛋白质活性，进而对人体造成损害，限制该类抑制剂的使用。

4.2含巯基抑制剂 在所有报道的MBLs抑制剂中，含有巯基的化合物数量最多，其中L-或D-卡托普利是最经典的含巯基抑制剂。临床中L-卡托普利是血管紧张素转换酶的抑制剂，其通过结合血管紧张素转换酶中的Zn2+起到缓解高血压的作用[30]。Brem等[31]报道了卡托普利在体外实验中可以抑制B1亚群的多种MBLs的活性。其中D-卡托普利对IMP-1、VIM-2、SPM-1及NDM-1的半数抑制浓度(inhibitory concentration at half-maximum，IC50)分别为7.2、0.072、261.8及20.1 μmol/L，D-卡托普利还可增强美罗培南对产VIM-2、VIM-4、IMP-4及NDM-1的细菌的抗菌活性。三维结构展示L-卡托普利的巯基取代了NDM-1两个Zn2+中间的氢氧化物，抑制了NDM-1活性。

Klingler等[32]报道了一系列巯基化合物，其中塞奥芬、二巯基丙醇、巯基丙酰甘氨酸可抑制NDM-1、VIM-1及IMP-7的活性(均IC50<100 μmol/L)。并且这些化合物与亚胺培南联合应用可提高后者对产NDM-1、VIM-2、IMP-7的大肠埃希菌实验分离株及肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌病原分离株的抗菌活性。

Hinchliffe等[33]报道了一系列含羟基的双环噻唑烷化合物，该类化合物是青霉素的类似物并且含有巯基。研究以亚胺培南作为底物。其中名为L-CS319化合物对NDM-1表现为强竞争性抑制作用，抑制常数(Ki)为7 μmol/L、IC50为23 mmol/L。体外实验中，L-CS319可以恢复亚胺培南对产NDM-1的肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌及雷氏普罗威登斯菌的抗菌活性。

4.3罗丹宁衍生物 罗丹宁是一类对青霉素结合蛋白、SBLs和MBLs均有抑制效果的抑制剂。Brem等[34]报道了罗丹宁与VIM-2形成的三维结构，并发现罗丹宁的一种派生物可以连接VIM-2活性位点的两个Zn2+。除SPM-1外，该派生物对于一系列B1亚群MBLs具有比罗丹宁更强的抑制能力。其对NDM-1、VIM-2及IMP-1的IC50分别为1.05、0.3和0.002 88 μmol/L。

与美罗培南联合进行的最小抑菌浓度研究显示，对于表达IMP-1、IMP-4、VIM-4或NDM-1的肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌临床分离株，罗丹宁表现的抗菌活性更强。这一结果可能是不同细胞对两种抑制剂的利用不同产生的结果。

4.4二羟酸衍生物 邻苯二甲酸及顺丁烯二酸的衍生物是常见的二羟酸类MBLs抑制剂。Hiraiwa等[35]报道的一系列邻苯二甲酸衍生物，其中对IMP抑制效果最强的一种抑制剂的IC50为0.27 μmol/L。该种邻苯二甲酸衍生物抑制剂可提高比阿培南对产IMP铜绿假单胞菌的抗菌活性。

Ishii等[36]报道的一种名为ME1071的顺丁烯二酸衍生物可以抑制IMP-1及VIM-2的活性，其Ki值分别为0.4和120 μmol/L。该研究同时报道了ME1071可增强头孢他啶及碳青霉烯类抗生素对产MBL的铜绿假单胞菌的抗菌活性。在小鼠肺炎模型中，Yamada等[37]发现ME1071可增强比阿培南治疗产IMP铜绿假单胞菌的感染。

4.5硼酸盐类 硼酸化物常作为SBLs的过渡态抑制剂，其通过与SBLs中的丝氨酸发生反应产生仿四面体抑制SBLs活性。Brem等[38]报道的一系列环状硼酸盐不仅可以通过上述机制抑制SBLs的活性，还可以通过类似的机制抑制青霉素结合蛋白5及多数B1亚群MBLs的活性。其中一种硼酸盐类抑制剂对IMP-1、VIM-2及NDM-1的IC50分别为1.44、0.003及0.029 μmol/L。体外实验中该种抑制剂可提高美罗培南对产NDM-1肺炎克雷伯菌的抗菌活性。

该类抑制剂虽然可以抑制SBLs与B1亚群MBLs的活性，但其对B2亚群MBLs的抑制效果很差。

4.6其他 除上文提到的抑制剂外，MBLs的抑制剂还有联苯氮杂类[39]、吡咯类衍生物[40]、磺酰类化合物[41]、磺胺衍生物[42]、异羟肟酸衍生物[43]及自然产物[44]等。在体外实验中，这些有机分子均可以抑制一种或几种MBLs，而且也可以提高β内酰胺类对产MBLs致病菌的抗菌活性。另外，还有一些MBLs抑制剂通过其他作用机制对MBLs产生抑制作用，如包含精氨酸多肽的大分子抑制剂通过改变蛋白质构象达到对MBLs的抑制作用[45]，以及甲酰色酮通过共价结合方式对MBLs产生抑制作用[46]等。

5 展 望

表达MBL的致病菌引起的感染性疾病不断增多，是亟待解决的临床问题。从细菌耐药的历史来看，其总是伴随着基因之间的水平传递以及地域性传播。NDM-1的全球播散也印证了这一特点。这也是抗生素应用所带来的重大挑战。在过去20多年中，有许多关于MBLs抑制剂的报道。一些研究报道了抑制剂的IC50和(或)Ki值，一些研究报道了三维结构和(或)毒理研究，一些研究还涉及了动物实验，但是目前的研究还停留在实验室阶段。MBLs种类众多，而且大多数抑制剂并不能抑制所有的MBLs，MBLs介导的细菌耐药使β内酰胺类抗生素这一在临床中应用最为广泛的药物失去抗菌活性。研发可逆的、靶向选择的、具有构效关系的MBLs抑制剂，使其既可以抑制MBLs又能恢复β内酰胺类抗生素活性，是解决这一挑战的关键。