血浆内毒素检测在革兰阴性菌引起肺部感染诊断中的应用

杨 辛，吴颖稚，范 君，钱重玲，林 洁，李 菁，张庆五，曹启迪

(1.上海市杨浦区控江医院检验科，上海 200093； 2.上海市杨浦区沪东老年护理医院检验科，上海 200082)

肺部感染是呼吸系统最常见多发的疾病之一，其病因是由于肺部感染病原微生物(以细菌感染为主)而引起的炎症。免疫功能低下，临床表现不典型，早期诊断困难。致使患者出现咳嗽、咳痰，伴或不伴胸痛，发热。由于肺部感染病原体种类不同，感染何种病原体不明，无法针对敏感菌准确用药，致使大量使用广谱抗生素，造成致病微生物的基因发生改变而产生耐药，其中以革兰阴性菌最为突出[1-2]。所以临床往往急需病原体检测，而常规细菌培养所需时间较长，为4～6 d，而且采集标本易污染，真阳性率不高，不利于疾病治疗[3]。近年来对细菌感染快速检测诊断的新试验项目不断增加，血浆内毒素对革兰阴性菌感染早期鉴别具有一定的诊断价值，革兰阴性菌的细胞壁上含有脂多糖，而其他革兰阳性菌、真菌、动物及人的细胞成分和血浆中均不含脂多糖成分，如果在感染患者血浆中检测到脂多糖，是诊断革兰阴性菌感染的有效依据[4]。本研究采用血浆内毒素动态光度比浊法对肺部感染患者脂多糖水平进行检测，旨在探讨其在革兰阴性菌诊断中的应用价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年6月至2018年5月上海市杨浦区控江医院确诊为肺部感染患者277例，其中男235例、女42例,年龄62～82岁，平均(73.3±1.2)岁；病程11～15 d,平均(13±2.0) d。纳入标准；符合2009年《临床诊疗指南；呼吸病学分册》肺部感染的诊断标准[5]；排除标准：排除肺部肿瘤、肺水肿、肺不张、肺栓塞等疾病，病毒性感染，自身免疫性疾病及过敏性疾病所致免疫功能紊乱的患者。

1.2仪器和试剂 采用法国(梅里埃)VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定药敏分析仪及相应革兰阳性菌，革兰阴性菌药敏卡均由法国梅里埃生物有限公司提供，上海市临床检验中心提供细菌质控标准菌株大肠埃希菌(ATCC25922),金黄色葡萄球菌(ATCC25923)，铜绿假单胞菌(ATCC27853)由细菌室保存。血平板，麦康凯及巧克力平板均由上海市康勤科技有限公司提供，采用英国(莱伯金耐特)LKMO2-32型动态试管检测仪(英国莱伯金耐特生物有限公司)检测内毒素水平，TAL-80试管恒温仪、革兰阴性菌脂多糖检测试剂盒(批号：1703240)及质控品均由广东湛江安度斯生物有限公司提供。

1.3方法

1.3.1血浆内毒素检测 采用革兰阴性菌脂多糖动态光度浊法检测血浆内毒素水平:①采用无菌，无热源真空采血管采集静脉血3 mL，离心半径为10 cm,3 000 r/m离心10 min后，吸取上层富有血小板的血浆0.1 mL加入0.9 mL样品稀释液中后，放入TAL-80试管恒温仪中进行75 ℃保温10 min和冷却5 min后，配制成检测血浆。②取0.25 mL试剂复溶液加入反应试剂中，摇匀静置2 min配制成反应液。③加入0.1 mL检测血浆和50 μL反应液于反应管中，混匀后插入LKM-02-32型动态试管测试仪中检测75 min反应结束后，自动计算血浆中内毒素的含量[6-7]。血浆内毒素定量检测结果分析：<0.053 EU/mL为正常值；0.053～0.109 EU/mL为临床观察期；>0.109 EU/mL为革兰阴性菌感染[8-9]。

1.3.2痰液细菌培养检测 受试者晨起洗漱后，深咳留取痰液于无菌试管内30 min送检，收到标本后初步镜检和革兰染色。合格标本判断标准为鳞状上皮细胞<10个/低倍视野，白细胞>25个/低倍视野为合格标本进行痰液培养[10]。先将痰液标本及时接种血平板，麦康凯和巧克力平板，放入35 ℃孵箱孵育24～48 h后取出。如怀疑有致病菌进行革兰染色，镜检区分阳性和阴性，确定后挑取单个菌落于2.0 mL无菌0.9% NaCl溶液中，调整菌落浊度为0.5麦氏比浊度后，分别接种于鉴定药敏板，放入VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定药敏分析仪中，24 h后自动出结果[11]。痰液细菌培养鉴定结果判定；根据文献[12-13]，按法国梅里埃生物有限公司提供的VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定药敏分析仪细菌鉴定评估标准说明书进行评定。

2 结 果

2.1痰细菌培养阳性率分布情况 277例肺部感染患者中，革兰阴性菌感染196例，阳性率为79.76%，分别为大肠埃希菌30例，铜绿假单胞菌52例，肺炎克雷伯菌94例，奇异性变形杆菌12例，鲍曼不动杆菌8例。革兰阳性菌感染81例，阳性率为29.24%，分别为金黄色葡萄球菌72例，肺炎双球菌9例。

2.2内毒素含量水平检测结果比较 196例革兰阴性菌感染患者血浆内毒素水平为(0.283±0.108) EU/mL，81例革兰阳性菌感染患者血浆内毒素水平为(0.034±0.010) EU/mL。革兰阴性菌感染组与革兰阳性菌感染组内毒素水平比较差异有统计学意义(t=29.773,P=0.001)。

2.3血浆内毒素与痰液细菌培养检测结果比较 以细菌培养结果作为金标准，血浆内毒素检测的灵敏度为97.44%，特异度为83.95%，阳性预测值为94.08%，阴性预测值为93.24%,准确度为93.86%。见表1。

表1 血浆内毒素与痰细菌培养检测阳性结果比较 (例)

3 讨 论

内毒素是革兰阴性菌细胞壁中的一种成分，称之为脂多糖。脂多糖对宿主具有毒性作用。内毒素只有当细菌死亡或裂解破坏菌细胞后才释放出来。革兰阴性菌是肺部感染的主要致病菌，临床上最常用痰培养来鉴定感染细菌的种类，并同时提供药物敏感试验结果。但培养时间较长，需4～6 d，无法提供及时的检验结果[14]。近年来，实验室运用血浆内毒素检测，不但可以快速鉴别致病菌种类，而且具有高度敏感性，尤其是革兰阴性菌感染，检测时间短，操作简单仅需2 h便可出结果，能及时为临床医师提供早期诊断和针对敏感菌如何应用抗感染药物治疗进行有效指导[15-16]。

本研究结果显示，277例肺部感染患者中，痰细菌培养阳性率分别为革兰阴性菌感染196例，阳性率为79.76%，革兰阳性感染81例，阳性率为29.24%，革兰阴性菌感染组血浆内毒素水平明显高于革兰阳性感染组(P<0.01)，因为革兰阴性菌裂解后释放出来内毒素是其细胞壁中的脂多糖组分，因此对于革兰阴性菌致病的肺部感染的患者，检测血浆内毒素可以确定革兰阴性菌感染，并且进行针对革兰阴性菌的抗生素治疗。如果肺部感染患者依赖血常规检查结果，发现白细胞计数升高不明显或在正常参考值范围以内影响使用广谱抗生素，等痰培养结果出来再调整用药方案，肺部感染患者可能会因抗生素使用不当而发生不良反应，产生延误患者病情[17]。本研究以血浆内毒素水平检测值>0.109 EU/mL作为临界值，血浆内毒素与痰细菌培养检测结果比较，血浆内毒素的灵敏度和特异度分别为97.44%和83.95%，阳性预测值为94.08%，阴性预测值为93.24%,准确度为93.86%，效能较好。痰培养不能区分感染菌和定植菌，而血浆内毒素能区分感染菌和定植菌，在对患者进行初步筛选过程中表现方便、快捷，所以血浆内毒素为诊断革兰阴性菌的有效方法。但是当人体局部或浅部革兰阴性菌感染时，因脂多糖较少释放入血或不入血，人体自身免疫系统能给予清除，造成血浆内毒素检测结果出现假阴性。另外血浆内毒素检测也会出现极低比例的假阳性结果，而导致假阳性因素有试验器材污染，患者用药，血清标本高溶血,高脂及高胆红素等。因此血浆内毒素检测结果应与临床患者体征相联系：①新出现的咳嗽、咳痰或原有的呼吸道症状加重；②发热；③肺实变体征和(或)闻及湿啰音；④白细胞计数>10×109/L或<4×109/L,伴或不伴中性粒细胞核左移；⑤胸部X线见片状、斑片状浸润性阴影或间质性改变。以上1～4项任何一项加上第5项的情况结合进行诊断和治疗[17-18]。血浆内毒素随病情恶化而升高，随病情缓解而降低，因此血浆内毒素检测可以作为监测病情变化的参考指标，并且还可用于指导临床用药和治疗。内毒素鲎试验检测是通过酶的级联反应，内毒素在二价阳离子参与激活C因子，然后激活其他酶原，产生一系列凝集美反应，目前应用鲎试验阳性对肺部感染的进行诊断，血浆内毒素水平>0.109 EU/mL为定量标准，并证实它对革兰阴性菌肺部感染患者的判断优于痰培养[19-21]。

综上所述，内毒素检测具备2 h得到检测结果，因此对于临床肺部感染患者应动态监测血浆内毒素含量。在未得出细菌培养结果的情况下，可早期确定患者感染的细菌种类，以利于临床合理选择针对内毒素的抗菌药物，而及时的治疗可以避免患者发生感染加重，导致不良后果。本法快速、简单、准确性高，可用于革兰阴性菌的辅助诊断。