神经元P2X7受体在疼痛调制中作用研究进展

李鹏涛 秦 颖 肖 智 刘俊光 张桂悦

疼痛往往是机体受到伤害性刺激引起的警戒信号，正常情况下的生理性疼痛对机体避免损伤有重要的意义，但有关痛觉调制机制的基础研究对临床镇痛有重要的理论指导意义和临床转化价值。由于外周伤害性感受器受到刺激后出现反应或中枢神经元兴奋性及突触效能的改变，急性期如得不到及时处治会转变为慢性疼痛(chronic pain)，导致患者生活质量下降，社会和医疗保健成本上升。诸多证据表明，嘌呤受体与疼痛调制存在紧密联系。本文对神经元P2X7受体特性、神经元P2X7受体在神经元凋亡机制中作用及P2X7受体在疼痛调制中作用进行探讨。

一、神经元P2X7受体结构特性

嘌呤受体分为两种：离子通道型和G蛋白偶联型(P2X和P2Y)受体。P2X受体目前在哺乳动物和其他脊椎动物中克隆出P2X1～7共7种亚型，其中，P2X7受体由于自身结构特点，使P2X7受体在炎症性疼痛、慢性疼痛、神经性疾病中作为触发剂或调节剂参与疼痛调制当中。P2X7受体是多聚体的配体门控阳离子通道，其基因编码区位于染色体12q24。P2X7受体不同于其他6个P2X受体亚型，具有两个跨膜结构域和一个胞外环。早期研究发现在外周系统中，P2X7受体表达于造血细胞中，如T淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞等，后来随着研究方法和检测仪器的进步，发现脑、脊髓、骨骼、肺等组织中存在。其中研究发现P2X7受体在大脑中主要表达在小胶质细胞，是否在神经元上表达和发挥功能存在争议[1]。近年来对于在神经元P2X7受体的表达研究呈现上升趋势，根据研究表明，在大脑延髓、脊髓和结状神经节的众多神经元中发现大量P2X7受体的存在中枢神经系统的突触前末梢，进一步研究证实P2X7受体激活促进突触前末梢突触囊泡的释放神经递质[2]。后来文献陆续报道发现P2X7受体存在脊髓神经元、视网膜神经元、海马脑片神经元、颈部交感神经节神经元，在受到刺激因子启动激活机制后发挥重要的生物学作用。随着药理学、生物工具应用的发展，越来越多的证据表明，神经元中不仅存在P2X7受体，而且P2X7受体活化后在神经等多个领域起着主导作用，包括轴突的延伸、分支和神经递质的释放，也参与了神经元的病理改变，直接诱导影响神经元的存活或间接引发神经元死亡的炎性反应[3]。在神经系统中诸如创伤、缺血和炎症等，都会造成细胞外核苷酸(ATP)浓度增加。

细胞外ATP在神经元和小胶质细胞通过刺激P2X7受体，活化后对神经系统功能起调节作用，并产生一系列生理或病理变化，包括中枢和外周神经系统突触递质释放量等突触传递效能的改变、平滑肌收缩、血小板聚集、巨噬细胞活化以及诱导细胞死亡等。目前研究表明P2X7受体表达于中枢小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元。由于P2X7受体在分子结构和功能上存在显著的自身特点使得P2X7受体在炎症、慢性疼痛、神经系统疾病(神经精神性疾病、神经退行性疾病、神经炎症性疾病)、肿瘤和细胞毒性的病理机制中有重要作用。

P2X7受体与其他P2X受体亚型不同，对ATP的亲和力较低，同聚体激活需要较高浓度的ATP(>100μmol/L)，该浓度大约是ATP激活其他P2X受体亚型的10倍。P2X7受体激活后通过启动胞内p38MAPK、ERK1/2以及NF-κB信号途径促进IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子和谷氨酸、一氧化氮(NO)、D-丝氨酸(D-serine)等神经递质的释放。根据组织、部位的不同，P2X7受体激活后产生的功能不同，例如，在小胶质细胞上P2X7受体活化，主要引起炎性因子和细胞因子的释放；在星形胶质细胞，P2X7受体活化主要引起D-serine的释放；在神经元，P2X7受体活化后通过与其它受体相互作用(P2Y1等)进而发挥作用。甚至在神经元不同部位的P2X7受体活化后产生不同的作用,小鼠小脑颗粒神经元突起P2X7受体活化促进谷氨酸的释放而胞体P2X7受体活化产生对抗兴奋性氨基酸毒性，促进颗粒细胞存活的作用[4]。根据已往研究发现，μ阿片受体和 NMDA受体在中枢神经系统多个区域有共表达。在vlPAG神经元胞体、树突存在大量的NMDA受体和μ阿片受体共表达，激活NMDA受体可对抗阿片系统的功能，减弱吗啡的镇痛作用，促进吗啡耐受的形成，而阻断NMDA受体后则促进吗啡的镇痛作用[5，6]。

二、神经元P2X7受体介导病理状态下神经细胞凋亡

在神经系统中，神经元的正常发育、神经功能的维持与神经细胞的增殖、分化、死亡有密切联系。神经元在不同的生长阶段通过细胞凋亡来进行新陈代谢，并促进、维持轴突与胞体发育成熟。神经元主要是通过信号通路，对上游和下游转导的信号进行整合与处理。如这些信号或信号通路出现异常，细胞凋亡程序会启动进行自我更新。细胞凋亡需要能量合成新的蛋白质，在ATP存在的情况下，P2X7受体在识别凋亡细胞的清除具有重要作用。疼痛是机体组织受到损伤或潜在组织损伤后引起局部产生伤害性信息，如ATP、H+、缓激肽等，膜发生去极化，这些信息通过伤害性感受器向上传导，将信息延信号通路传递到大脑皮质(通过外周伤害性感受器传导至中枢神经系统)进行信息整合。神经元P2X7受体激活后启动胞内p38 MAPK、ERK1/2以及NF-κB多种信号途径，促进细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α等)和神经递质(谷氨酸、NO等)释放，诱导异常神经元发生凋亡。

神经元P2X7受体受到伤害性刺激诱导神经细胞死亡，主要通过细胞外ATP激活P2X7受体间接引发神经元死亡的炎性反应，进一步促进白细胞介素-1β释放影响神经细胞死亡；轴索损伤后，P2X7受体信号参与神经元细胞凋亡。IL-1β是神经退行性病变、慢性炎性及慢性疼痛的重要介质。最新研究发现，运动神经元对P2X7受体活化高度敏感，通过运动神经元内的过氧亚硝酸盐/细胞死亡通路(FAS/FAS-L)为切入点引起细胞凋亡。神经元凋亡在神经病理性疼痛、慢性疼痛和其他神经退行性病变起着重要的作用，已有研究证实，神经细胞凋亡与神经病理性疼痛之间有着密切的联系。

三、神经元P2X7受体参与介导神经细胞凋亡途径

神经元P2X7受体表达的变化通过Ca2+诱导细胞凋亡，机制是主要由于蛋白质参与Ca2+的保存与运输，其中许多是在细胞内的细胞器中表达，包括内质网、线粒体和溶酶体。另外，线粒体、内质网也产生活性氧(ROS)。

1.内质网:内质网(endoplasmic reticulum, ER)的作用主要体现在整合和促进快速钙离子信号的能力，能力大小决定它在细胞质中储存、缓冲和释放钙离子的作用。组织损伤后细胞外ATP大量释放，神经元P2X7受体被激活，造成大量的Na+和Ca2+从细胞外进入细胞内，胞质内Ca2+骤增，引起持续P2X7受体被激活，造成细胞内Ca2+超负荷进而被动导致神经元损伤，不仅Ca2+平衡被打破，而且平滑肌细胞内的钙释放通道(IP3R)持续释放，钙库内存储消耗明显，内质网功能受损失去维持稳态的作用，出现内质网应激和下游信号通路的活化[7]。有研究发现P2X7受体拮抗剂通过抑制炎性反应和氧化应激减轻神经损伤，机制可能是内质网应激(ER stress,ERS)引起caspase-7和caspase-12被激活，造成信号通路异常，启动神经元程序性死亡，说明多种疾病如神经病变、炎性疾病、肿瘤、神经病理性疼痛等[8,9]。持续内的质网应激可以引起多种疾病，内质网出现应激反应后通过调控相关疾病信号途径包括p38MAPK、NF-κB、p53信号途径等。

2.线粒体：线粒体的功用主要是细胞代谢中心、参与能量代谢、生成ATP等。在神经元凋亡中的作用包括释放caspase激活因子，调节细胞内Ca2+浓度等。ATP可以通过多种途径激活嘌呤受体。在脊髓背角神经元，ATP不仅可以诱导活性氧的产生，ATP还可以激活脊髓神经元P2X7受体释放谷氨酸兴奋性神经元，造成线粒体内Ca2+内流增加，线粒体膜受损，Ca2+通透性增加。由于活性氧失衡，活性氧可以通过脂质氧化造成线粒体DNA受损，线粒体呼吸链中断，进一步加重膜损伤，ATP合成减少，周而复始，通过神经元P2X7受体的变化，诱导线粒体出现功能障碍，造成神经细胞凋亡。另一方面，有可能是与ATP诱导引起的神经元死亡、神经元P2X7受体表达水平有关[10]。

3.P2X7受体激动剂：研究发现P2X7受体在胶质细胞活化，是炎性疼痛和神经病理性疼痛的治疗靶点，根据Munoz等[11]研究发现P2X7受体激动剂(BzATP)注射后引起了神经元P2X7受体的活化，具体表现为BzATP激活SCDH神经元P2X7受体，引起活性氧(ROS)增加，诱导脊髓神经元的氧化损伤，证实神经元P2X7受体激活诱导活性氧的产生。在神经元，BzATP效果仅仅是由于神经元P2X7受体直接激活[12]。根据相关研究发现，P2X7抑制剂BBG、oATP和KN-62阻止BzATP诱导的运动神经元死亡，在培养的神经祖细胞中P2X7受体控制神经元的凋亡与增殖，主要机制可能是由于导致ATP释放增加和细胞过度增殖的病理状态有关[13，14]。另外，研究显示BzATP也可以诱导caspase-3活性增加，促进神经元凋亡，这一途径是否与神经元P2X7受体表达有关，需进一步验证。

四、神经元P2X7受体在神经系统作用研究

1.神经元P2X7受体在中枢神经系统的作用：根据Sperlagh等[15]研究表明，海马脑片发现神经元P2X7受体的表达，主要位于CA1区和CA3区兴奋性神经末梢，通过激活P2X7受体调控谷氨酸和GABA的释放；ATP无法直接调节谷氨酸和GABA的释放，而是由神经元P2X7受体激活后启动胞内p38MAPK信号转导途径来调节的。根据Metzger等[16]的报道，通过对小鼠进行基因研究P2X7受体表达，证实在基本条件下，P2X7受体普遍表达在小胶质细胞等非神经元细胞外；发现在海马CA3区谷氨酸神经元存在P2X7受体表达,具体定位于谷氨酸锥体神经元的胞体。Sncheznogueiro等[4]的研究表明，在小鼠小脑颗粒细胞神经元中也存在P2X7受体分布，可以在轴-树突和体细胞进行功能性表达，小鼠小脑颗粒神经元突起P2X7受体活化促进谷氨酸的释放，而胞体P2X7受体活化产生对抗兴奋性氨基酸的毒性，促进颗粒细胞存活。有研究发现在中枢神经系统受损后，谷氨酸神经末梢的P2X7受体，可以通过引起钙超载和谷氨酸的作用，控制大脑皮质中兴奋性突触的传递和神经元的进一步损伤。以上研究说明P2X7受体不仅在神经元表达，还发挥着重要的生物学功能。

2.神经元P2X7受体在外周神经系统的作用：根据Munoz等[16]研究表明在中枢神经系统P2X7受体信号通路中，神经元P2X7受体激活导致活性氧(ROS)产生和引起的一系列疼痛反应中起着重要作用，通过应用P2X7受体拮抗剂可以阻断ATP诱导产生兴奋性神经元，减轻神经性疼痛，说明脊髓背角P2X7受体不仅存在于免疫细胞中，也存在于非免疫细胞中，并对疼痛信号通路产生影响。脊髓损伤后造成神经元损伤，会引起不同程度的感觉、运动障碍。根据研究表明，脊髓运动神经元表达丰富的P2X7受体，脊髓运动神经元中P2X7受体的激活导致细胞内Ca2+浓度不可逆地增加，说明Ca2+浓度与神经元P2X7受体表达及发挥作用密切相关。

五、神经元P2X7受体与疼痛

1.神经元P2X7受体在神经病理性疼痛中的作用：目前对神经病理性疼痛具体分子机制还没有研究明确，大部分是从各种信号通路转导环节去研究，如炎性介质信号通路、活性氧信号通路等。神经病理性疼痛通过诱导活化神经元P2X7受体，导致活性氧增加，引起内质网应激，造成神经元凋亡。根据葛彦虎[17]对内质网应激脊髓片段进行辣椒素处理，发现脊髓背角浅层神经元的变化，说明内质网应激途径可能参与了神经病病理性疼痛的发生、发展。另据研究表明，在神经病理性疼痛模型中，腹腔注射活性氧清除剂(PBN)，能显著降低痛觉过敏和阻断脊髓pNR1增强，活性氧(ROS)可以通过激活NMDA受体，这一步在中枢敏化过程中作用明显，说明活性氧(ROS)在神经病理性疼痛中起着重要作用[18]。根据张莉研究锌可以抑制脊髓神经元凋亡和兴奋性肽表达，说明神经元凋亡参与、调节神经病理性疼痛。有实验研究发现在慢性坐骨神经缩窄性损伤模型(CCI)中，脊髓背角中GRP78(内质网应激标志性蛋白)、caspase-12和caspase-3的表达增高，说明坐骨神经受损引起脊髓背角出现内质网应激，同时实验观察到脊髓背角中神经元凋亡染色阳性数目增多的现象，表明脊髓神经元P2X7受体在CCI模型中参与内质网应激，进一步说明内质网应激引起神经元凋亡在神经病理性疼痛中起着明显作用[19]。证明神经元P2X7受体可能参与这一途径。由于在海马脑片CA1区兴奋性神经末梢发现神经元P2X7受体的表达，结合SNL模型发现海马CA1区锥体神经元树突棘密度增高，说明海马CA1区神经元P2X7受体在神经病理性疼痛发挥着一定作用。

2.神经元P2X7受体在炎性疼痛中的作用：在神经系统中，由于机体组织在病理状态下受到刺激，引起炎性反应，大多数研究只关注神经胶质细胞对炎性反应的作用，而忽视神经元自身的防御机制。Lim等[20]研究表明，神经元P2X7受体激活与神经元受到张力牵拉的刺激，导致pannexin通道打开，释放ATP，进一步使P2X7受体激活，引起一系列炎性反应。应用P2X7受体阻断剂进行的实验表明，P2X7受体与pannexin通道之间存在一定关联。虽然，目前未明确在神经节细胞P2X7受体阻断剂，以何种信号通路促使pannexin通道打开释放ATP，激活神经细胞P2X7受体，但嘌呤受体自分泌学说的提出，有可能为以后在疼痛有关研究中提供指导[21]。

3.神经元P2X7受体在癌性疼痛中的作用：癌性疼痛不仅包含组织、神经的损伤，而且肿瘤细胞和癌周组织可释放、分泌特殊的致痛因子——既包含炎性疼痛成分，也有神经病理性疼痛成分。近年来，在肿瘤和癌性疼痛的机制研究中发现，在肿瘤微环境中，肿瘤细胞可以主动释放ATP或瘤细胞坏死后释放ATP，形成一个局部高浓度的ATP环境，进而激活P2X受体。研究结果提示ATP和P2X受体激活介入了肿瘤生长、转移以及肿瘤血管生成机制。有文献报道，使用P2X7受体基因敲除小鼠或对小鼠皮下注射P2X7受体拮抗剂A-438079均不能缓解小鼠骨癌痛；同时该研究还发现P2X7受体基因敲除小鼠其骨癌痛出现时间反而较野生型小鼠早，疼痛症状更严重[22]。目前，神经元P2X7受体介导癌性疼痛存在一定争议，本课题组成功建立骨癌痛模型，进一步研究神经元P2X7受体是否参与癌性疼痛的调节控制。

六、展 望

通常在组织损伤后，经过神经细胞之间信息交流刺激信号传到大脑。神经细胞之间的连接被称作“神经突触”。突触接收到信号后造成离子通道的开放，特别是钙离子通道，进而引起离子内流，将信号进行传递。电信号与化学信号转换瞬间完成，神经递质释放，作用于目标靶点。近来，Prakriya等揭示了钙离子通道蛋白CARC通道的开放与关闭过程，详细阐述其细节，并鉴定出了离子通道在静止状态与开放过程中的分子结构[23]。科研人员进一步研究发现，在离子通道中存在一定间隙，中间有水分填充。这为药物研究提供新的思路：关闭空隙时可以利用亲脂性的化学基团组织水分子及离子的浸入，而通道打开时，疏水性的基团挪开保证水分子及离子进入。P2X7受体属于门控性离子通道，是否可以应用以上方法减少神经元P2X7受体的激活降低痛阈，值得我们进行深入研究。

Fernandes等[24]研究发现，神经元发育协调需要通过神经胶质细胞群体作用实现，神经胶质细胞将来自视网膜的信号传到大脑皮质中，并将大脑中的细胞变成神经元。通过传递信号的转导变化，说明神经胶质细胞对神经元可以进行精准调制。而在神经元上发现的P2X7受体表达是否是由小胶质细胞P2X7受体转化而来，还需要进一步研究探讨。

综上所述，对神经元P2X7受体的生物学功能研究尚处于初级阶段，本文介绍了神经元P2X7受体的存在性及经过内质网应激等途径造成神经细胞凋亡，通过两者之间的信息转化及传递在疼痛调制方面的作用，并简要指出离子通道及脑内P2X7受体表达。目前，对于神经元P2X7受体具体机制还不清楚。如能将上述机制阐明，将有助于解决疼痛调制机制、药物靶点镇痛机制、离子通道阻断机制，为临床用药及药物研发提供新的潜在思路。