CSF-1R在鼻咽癌细胞株中的表达情况及对细胞增殖、凋亡、侵袭转移能力的影响

曾 兵 郭海霞 徐清榜 张晓旻 郭莉莉 万 野

集落刺激因子1 受体(CSF-1R)是免疫系统中最主要的调节因子之一，由原癌基因c-fms 编码而产生。通过调节单核-吞噬谱系细胞的生成与生物活性来影响肿瘤的进一步发展。在体内，CSF-1 通过结合CSF-1R 后自身磷酸化，并激活其磷酸化激酶域。与此同时，配体、受体结合形成二聚体形式。然后，效应蛋白的酪氨酸残基磷酸化，引起巨噬细胞活化。被激活的单核巨噬细胞系统可以通过许多途径促进肿瘤的发展，例如促进肿瘤生长、促进肿瘤新生血管生成、促进肿瘤细胞外基质分解以及促进肿瘤细胞的侵袭和转移。此外，CSF-1/CSF-1R 也直接影响肿瘤细胞的生长。目前，已有多种研究表明，CSF-1/CSF-1R 在各种恶性肿瘤中高表达[1～3]。但遗憾的是，目前仍没有CSF-1 /CSF-1R 是否影响鼻咽癌进展的相关报道。本研究通过实时荧光定量PCR 及Western blot法从细胞实验层面探讨CSF-1R 在鼻咽癌细胞中的表达对细胞增殖、凋亡、侵袭转移能力的影响。笔者希望能为鼻咽癌的诊断及预后找到一个新的预测指标以及可能成为鼻咽癌患者的治疗新靶点。

对象与方法

1.对象：(1)细胞：5-8F、6-10B 鼻咽癌细胞株及NP69 永生化正常鼻咽上皮细胞株购自APTT细胞库，CNE-2 鼻咽癌细胞株由笔者医院实验中心惠赠。5-8F、6-10B、CNE-2 鼻咽癌细胞株使用RPMI1640 培养基混合10%胎牛血清于37℃，5%CO2培养箱中培养。NP69鼻咽上皮细胞株使用加入0.05mg/ml BPE 和5ng/ml EGF 的 K-SFM 培养基于37℃，5%CO2培养箱中培养。(2)主要试剂：CSF-1R 兔抗人单克隆抗体(ab61137)购自英国Abcam公司；鼠抗兔多克隆即用型二抗购自中杉金桥公司；免疫组化试剂盒购自中杉金桥公司；DAB 显色试剂盒购自中杉金桥公司；南美洲胎牛血清购自美国Gibco公司；RPM1640 基础培养基购自美国Gibco公司；K-SFM 培养基购自美国Gibco公司；细胞总RNA 抽提试剂盒购自天地扬生物科技公司；反转录试剂盒购自天地扬生物科技公司；荧光定量PCR 试剂盒购自天地扬生物科技公司；RIPA 裂解液购自碧云天生物技术研究所；CSF-1R 兔抗人单克隆抗体购自美国CST 公司；鼠抗兔多克隆抗体购自中山金桥公司；ELC 发光系统购自碧云天生物技术研究所。

2.免疫组织化学实验检测治疗前组织标本的CSF-1R 蛋白：将切片置于烤片架上放入60℃烤箱中烤片2h。将切片浸泡于二甲苯中脱蜡，15分钟/次，共3次。然后按从高浓度到低浓度的顺序，依次将切片浸泡于梯度乙醇(乙醇浓度依次为：100%、95%、90%、80%、70%)中，每个浓度中均浸泡5min。然后用双蒸水洗片5分钟/次，共3次。接着用 PBS 洗片5分钟/次，共3次。具体步骤严格按照试剂盒说明进行。每一批次实验中均设置阳性对照片和阴性对照片。已知阳性反应标本做为阳性对照，与实验切片采用同种一抗、二抗。PBS 代替一抗作为阴性对照进行同步染色。

3.实时荧光定量PCR检测：应用Primer5.0 引物设计软件设计引物，并由Life Technologies 公司合成：CSF-1R:上游引物：5′-TCTGGTCCTATGGCATCCTC-3′，下游引物：5′-GATGCCAGGGTAGGGATTC-3′；Cyclin D1:上游引物，5′-GCGAGATGAGGCGATGGGGC-3′,下游引物：5′-CCTTCAGGGCGGCTGTGGTG-3′；Bcl-2:上游引物：5′-GTGACTTCCGATCAGGAAGG-3′，下游引物:5′-CTTCCAGACATTCGGAGACC-3′；BAX:上游引物：5′-AGTAACATGGAGCTGCAGAGG-3′，下游引物：5′-ATGGTTCTGATCAGTTCCGG-3′；MMP-2:上游引物：5′-ACTGTTGGTGGGAACTCAGAAG-3′，下游引物：5′-CAAGGTCAAT GTCAGGAGAGG-3′；GAPDH:上游引物：5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游引物：5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。5-8F、6-10B、CNE-2、NP69 4株细胞分别培养之后使用胰蛋白酶处理制成细胞悬液，用细胞计数板计数细胞后，取含有约1×106个细胞的细胞悬液转移至RNase-Free 的离心管中，离心收集细胞沉淀。其余步骤严格按照试剂盒说明进行。实时荧光定量PCR 实验结果采用△△CT 计算方法，即样品mRNA 值=2-△△CT。△CT=目的基因CT 值-内参基因CT 值；△△CT=实验组△CT-对照组△CT。实验组即5-8F、6-10B、CNE-2 细胞株；对照组即NP69 细胞株。

4.Western blot法检测：5-8F、6-10B、CNE-2、NP69 4株细胞分别培养约1×106个细胞后， 用PBS 洗2遍，然后用含有PMSF 的RIPA 裂解液300μl 处理细胞，吹打数下，使裂解液充分接触细胞，待细胞充分裂解后，14000×g离心5min，取上清分装于EP 管中保存于-70℃冰箱内。Western blot法实验条带采用扫描仪图像扫描后，用Quantity One 4.6.2 软件进行条带处理分析。目标蛋白相对表达量=目标蛋白灰度值/内参灰度值。实验组为5-8F、6-10B、CNE-2 细胞株；对照组为NP69 细胞株。

结 果

1.实时荧光定量PCR检测CSF-1R的表达情况：如图1、表1所示，发现5-8F细胞株中CSF-1RmRNA的表达明显高于NP69细胞株(P=0.000)，6-10B细胞株中CSF-1RmRNA的表达明显低于NP69细胞株(P=0.000)，CNE-2细胞株中CSF-1RmRNA的表达水平略高于NP69细胞株，差异无统计学意义(P=0.057)。

图1 实时荧光定量PCR检测

表1 5-8F、6-10B、CNE-2及NP69细胞株中CSF-1RmRNA的相对表达水平

2.Western blot法检测CSF-1R的表达情况：如表2所示，发现仅5-8F鼻咽癌细胞株中CSF-1R蛋白表达阳性，6-10B(P=0.370)、CNE-2(P=0.480)鼻咽癌细胞株及NP69正常鼻咽上皮细胞株中CSF-1R蛋白表达均为阴性(图2)。5-8F细胞株相对于NP69细胞株明显呈现CSF-1R蛋白高表达(P=0.007)。

表2 CSF-1R在5-8F、6-10B、CNE-2及NP69细胞株中的相对表达量比较

图2 Western blot法检测结果

3.CSF-1R与细胞增殖因子CyclinD1、凋亡因子Bcl-2及BAX、侵袭转移因子MMP-2的相关性：如表3所示，发现5-8F细胞株中CyclinD1mRNA的表达水平均显著高于6-10B细胞株(P=0.000)。5-8F细胞株中表达的Bcl-2mRNA显著高于6-10B细胞株(P=0.000)，BAXmRNA显著低于6-10B细胞株(P=0.000)，Bcl-2mRNA/BAXmRNA比值显著高于6-10B细胞株(P=0.000)。5-8F细胞株中MMP-2mRNA的表达水平显著高于6-10B细胞株(P=0.000)。

表3 5-8F与6-10B细胞株中CyclinD1、Bcl-2、BAX、MMP-2mRNA的表达水平对比 (n=10)

讨 论

CSF-1是由巨噬细胞、成纤维细胞和肿瘤细胞等非造血细胞合成分泌的一个负责激活巨噬细胞，并促进其增殖、分化的重要的生长因子。它通过结合其受体CSF-1R，促进细胞外结合域构象的改变，使得其相邻受体细胞间的交互作用更稳定，从而形成二聚体。同时促进二聚体细胞质酪氨酸残基磷酸化，进一步调节其效应细胞的生长、成熟，激活相应的靶细胞，多方面协同效应促进肿瘤进一步发展[4]。研究发现CSF-1R在头颈部肿瘤中表达异常增高，并且在结直肠癌中也发现CSF-1R表达高于正常组织[5]。然而，到目前为止，据笔者查阅文献，本研究首次提出了CSF-1R在鼻咽癌组织中呈现高表达水平。并且笔者从多个角度证明了这种高水平的表达与鼻咽癌的预后有一定的关联性。CSF-1R主要表达在鼻咽癌肿瘤组织细胞的核膜上，其次在细胞质中也有少量表达。免疫组织化学结果显示，CSF-1R在鼻咽癌中明显高表达(P=0.000)。但Sabitha Aligeti等研究显示当内源性的CSF-1/CSF-1R过度表达时，卵巢癌细胞的侵袭能力、附着力，以及能动性增加，肿瘤侵袭转移的概率大大增加[6]。

通过实时荧光定量PCR和Western blot法实验发现5-8F细胞株中CSF-1R在基因水平和蛋白水平均显著高表达(P=0.000、P=0.007)，而6-10B细胞株中CSF-1R在基因水平明显低表达(P=0.000)，但蛋白水平与NP69正常鼻咽上皮细胞株一样均显示为阴性表达(P=0.370)。说明6-10B不论是在基因水平，还是在蛋白水平均表现为CSF-1R低表达状态。此外，CNE-2细胞株中CSF-1R在基因和蛋白水平的表达呈现与NP69差别不大(P=0.057、P=0.481)。因此，笔者选取CSF-1R高表达细胞株5-8F和CSF-1R低表达细胞株6-10B进行进一步研究。CyclinD1是调控细胞由G1期向S期转化的周期素。当CyclinD1基因扩增时，细胞增殖周期将失调，从而促进肿瘤的发生。

本研究发现，CSF-1R高表达细胞株5-8F中CyclinD1的表达水平明显高于CSF-1R低表达细胞株6-10B(P=0.000)，说明5-8F鼻咽癌细胞增殖能力明显强于6-10B。Bcl-2抗凋亡蛋白和Bax促凋亡蛋白在鼻咽癌细胞凋亡调控过程中起到了重要作用。鼻咽癌细胞中，Bcl-2存在于细胞线粒体上，通过改变线粒体膜的通透性阻止细胞色素C的释放而发挥抗凋亡作用。Bax则通过与线粒体膜上Bcl-2结合形成同源二聚体，参与构成跨线粒体膜的孔道蛋白，从而降低跨膜电位引导细胞色素C的外流引起细胞凋亡。Bcl-2与Bax表达的平衡直接决定细胞是否凋亡，因此，Bcl-2与Bax的比率(Bcl-2/Bax)是临床肿瘤预后的标志物之一[7]。

本研究发现相对于细胞株6-10B细胞株，5-8F中凋亡因子Bcl-2明显高表达、Bax明显低表达(P=0.000、P=0.000)。5-8F细胞株中Bcl-2/Bax高于6-10B细胞株(P=0.000)。换句话说CSF-1R高表达细胞株5-8F的凋亡水平低于CSF-1R低表达细胞株6-10B。肿瘤从原发灶向周围组织侵袭转移的过程中，必须先降解细胞外基质和基膜，而基质金属蛋白酶基因家族在这一过程中起到了重要作用。MMP-2是基质金属蛋白酶基因家族中降解Ⅳ型胶原最主要的酶之一。在多种肿瘤如头颈组织、肺、乳腺、前列腺、直肠等的进展过程中发挥着重要作用[8～11]。

本研究发现，5-8F细胞株中MMP-2侵袭转移因子表达水平明显高于CSF-1R低表达细胞株6-10B细胞株(P=0.000)，说明5-8F细胞的侵袭转移能力强于6-10B细胞。通过将CSF-1R高表达细胞株5-8F和CSF-1R低表达细胞株6-10B中CyclinD1、Bcl-2/Bax、MMP-2的表达水平进行比较，发现CSF-1R高表达细胞株5-8F的增殖、侵袭转移能力更强，而细胞凋亡能力则较弱。由此，笔者预测CSF-1R高表达的鼻咽癌患者更容易发生肿瘤进展，预后更差。这一结果正好与鼻咽癌组织免疫组化的结果相吻合。虽然CSF-1R高表达诱导鼻咽癌进展的具体机制尚不清楚，还有待于进一步研究。但就目前了解的资料来看，这可能与CSF-1/CSF-1R依赖性的巨噬细胞异常活跃有关[12]。其他肿瘤研究的证据也支持笔者此观点。Allavena等[13]在骨肉瘤小鼠模型中的研究表明，CSF-1/CSF-1R过表达可以促进肿瘤相关巨噬细胞的分化和功能的激活，从而促进肿瘤快速进展且预后较差[14，15]。因此，笔者预测在不远的将来CSF-1R或许成为鼻咽癌诊疗的一个潜在靶点。

综上所述，鼻咽癌细胞与正常鼻上皮细胞株之间CSF-1R的表达差异有统计学意义。CSF-1R的表达与细胞增殖因子CyclinD1、凋亡因子Bcl-2及BAX、侵袭转移因子MMP-2的表达有一定的相关性，CSF-1R表达水平越高，细胞的增殖、侵袭转移能力越强，凋亡能力越弱。