艾塞那肽对高糖诱导INS-1细胞内质网应激及JNK信号通路的影响

张 强 陈 轩 徐 亮

2型糖尿病(T2DM)是一种常见的、多发的内分泌失代谢性性疾病，其发病环节主要是胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)和胰岛β细胞功能受损。现相关研究发现内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)、炎性反应是导致糖尿病、IR和肥胖发生的重要途径。胰高血糖样肽-1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)是肠-胰岛轴中控制T2DM最核心的介导因子，可抑制β细胞凋亡并促进β细胞在体外和体外培养的细胞增殖[1]。艾塞那肽是第一个获得FDA批准用于临床的短效GLP-1类似物类降糖药[2]。

材料与方法

1.研究材料:小鼠INS-1细胞购自上海华拓生物有限公司；培养基(DMEM，1640)、平衡盐溶液(PBS)、澳洲胎牛血清(FBS)及胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)或应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)抗体、免疫球蛋白结合蛋白(BiP)、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、凋亡蛋白(caspase-3)、内参(β-actin)购自美国Cell Signaling Technology(CST)公司；RIPA裂解液、PMSF酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BSA封闭液、山羊抗鼠、山羊抗兔、MTT试剂盒、PVDF膜发光试剂盒(BeyoECL Plus)购于碧云天生物技术公司；JNK激动剂(Anisomycin)购于Selleck公司；艾塞那肽(Exendin-4)购于美国MCE公司。

2.细胞分组及培养：根据细胞生长情况，将对数期生长的INS-1细胞按不同的处理方式分为4组：对照组(A组，完全培养基)、高糖组(B组，30mmol/L高糖培养基)；高糖+100nmol/L艾塞那肽组(C组)；高糖+100nmol/L艾塞那肽+250ng/ml JNK激动剂(Anisomyci)组(D组)；完全培养基(含10%胎牛血清及1%双抗的1640培养基)，于37℃、5%CO2孵箱中培养，每隔24h换液1次，高糖组采用间断性高糖刺激(即30mmol/L高糖培养基与正常糖浓度培养基24h交替培养)，C组培养(高糖+100nmol/L艾塞那肽与正常培养基+100nmol/L艾塞那肽24h交替培养)，D组前5天培养为(高糖+100nmol/L艾塞那肽与正常培养基+100nmol/L艾塞那肽24h交替培养)，最后2天加入250ng/ml JNK激动剂处理。培养7天后提取总蛋白，提取蛋白保存于-80℃冰箱备用。每天换液前，于500倍相差显微镜下观察各组细胞的生长情况。MTT法检测细胞的活性，用酶标仪检测其在490nm波长下的吸光度值(A值)。

3.Western blot法检测Bip、CHOP、P-SAPK/JNK、caspase-3蛋白的表达量：用预冷的PBS液洗细胞3次，吸尽PBS后，加入含1% PMSF酶抑制剂及1%磷酸酶抑制剂的细胞裂解液(RIPA)约400μl提取各组细胞总蛋白，离心(20000r/min 15min)去除沉淀，BCA测定蛋白浓度，加5×上样缓冲液煮沸(100℃ 5min)，取相同质量的蛋白上样，硫代硫酸钠．聚丙烯酰胺(SDS．PAGE)凝胶电泳；转移至硝酸纤维素膜(PVDF)，5%的BSA常温下封闭1h，TBST洗膜3次(每次5min)，一抗(1∶1000)4℃摇床孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗(1∶1000)室温孵育1h，TBST洗膜3次后，曝光显影。利用图像分析软件Fusion对条带进行灰度值定量分析，用“目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值之比”代表靶蛋白的相对表达量。

结 果

1.显微镜下观察各组细胞的生长情况：与对照组比较，高糖组培养至第4天细胞开始出现死亡，第6、7天死亡细胞较多；JNK激动剂组在激动剂刺激后出现大量细胞死亡，高糖+艾塞那肽组与对照组比较细胞存活状态无明显变化，详见图1。

2.MTT检测各组细胞的活性：高糖组、JNK激动剂组细胞的吸光度与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；高糖+艾塞那肽组细胞的吸光度与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，详见图2。

图2 各组细胞的A值

3.各组细胞经过不同处理7天后Bip、CHOP、P-SAPK/JNK、caspase-3蛋白的表达量。间歇性高糖刺激组上调Bip、CHOP、P-SAPK/JNK、caspase-3表达量，与对照组比较，分别增加1.70、1.21、1.12、1.15倍(P<0.05)；高糖+艾塞那肽组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；高糖+艾塞那肽+激动剂组，上调P-SAPK/JNK、caspase-3表达量，与对照组比较，分别增加1.14、1.22倍(P<0.05)，Bip、CHOP与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见图3。

图3 培养7天后各组蛋白质的表达量

讨 论

早期研究已经证实T2DM的发病环节主要是胰岛素抵抗(IR)和胰岛β细胞功能受损，但确切机制尚未阐明。近年来有研究认为炎性反应在IR、T2DM和肥胖的发病中起重要作用。2004年Ozcan等[3]则提出内质网应激(ERS)是导致糖尿病、IR和肥胖发生的重要途径。在肥胖小鼠模型中，检测肝脏、脂肪和肌肉组织中内质网应激的标志分子，如双链RNA依赖蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、翻译起始因子2α(eIF2α)和c-Jun氨基端激酶(JNK)的磷酸化水平以及葡萄糖调节蛋白(BiP)mRNA表达水平。结果显示，肝脏和脂肪组织中上述4种分子的磷酸化和mRNA水平均显著增强。在内质网应激时，肌醇需求激酶-lα(IRE-lα)磷酸化增强，导致肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子2的募集而激活JNK。由此提示，内质网应激通过IRE-1α和JNK依赖的蛋白激酶级联通路促进胰岛素受体底物(IRS-1)的丝氨酸磷酸化，进而影响胰岛素的信号转导，导致IR。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)由末段回肠和结肠神经内分泌L细胞产生。其生物活性主要包括促进胰岛素的分泌、改善胰岛素对血糖的敏感度、抑制胰高血糖素的分泌、保护胰岛细胞，减少胰岛细胞的凋亡、抑制胃排空和胃酸的分泌等[4～6]。有研究表明，2型糖尿病患者血液中的GLP-1量及效应明显低于正常患者[7]。在体外试验中，Exendin-4通过抑制IRE1-JNK-caspase-3信号通路减少叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的β细胞凋亡，GLP-1还通过抑制 NF-κB信号通路抑制IL-1β诱导的INS-1细胞损伤[8，9]。

本研究结果显示，参与内质网应激的特异性相关信号分子CHOP和BiP蛋白在高糖刺激组有高表达，而高糖+艾塞那肽组CHOP和BiP蛋白相对于对照组，差异无统计学意义，揭示了高糖可诱导内质网应激，而艾塞那肽可抑制内质网应激。高糖+艾塞那肽+JNK激动剂组通过艾塞那肽抑制内质网应激,相比于B组下调CHOP及BiP的表达量下调，同时JNK激动剂激活JNK信号通路上调P-SAPK/JNK及特异性凋亡信号分子caspase-3表达量，同时相对于对照组，高糖刺激组P-SAPK/JNK表达上调，揭示了通过高糖的刺激可能与JNK信号通路有关。多项研究表明，β细胞是对内质网应激最为敏感的组织之一，内质网应激介导的β细胞凋亡是糖尿病发病的重要机制[10]。Wang等[11～14]研究发现长期高糖处理可引起大鼠胰岛素瘤细胞系INS-1细胞中内质网应激特征性标志分子如CHOP和BiP表达增加，推测长期高糖通过引起蛋白质合成的过度负荷导致内质网应激。

综上所述，GLP-1类似物艾塞那肽可通过抑制高糖诱导的INS-1细胞的内质网应激，进而抑制JNK信号通路，保护胰岛细胞，减少细胞凋亡，从而达到治疗T2DM的效果。