表达异源木糖异构酶对谷氨酸棒杆菌利用木糖的影响

李燕军 ，毛 倩，韩洪军，高立栋，张顺棠，丁念念，陈 宁

(1. 代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2. 莲花健康产业集团股份有限公司博士后科研工作站，项城 466200)

随着石化资源的日益消耗和环境污染的日益突出，开发以生物资源为基础的石化经济的替代路线对社会可持续发展具有重要意义．利用微生物对生物质原料进行发酵转化是生物经济的核心环节．廉价的木质纤维素原料是储量巨大的生物质资源，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成．现行发酵工业主要以粮食来源的淀粉糖为原料，对粮食安全构成一定的威胁，开发以农林废弃物为代表的木质纤维素原料作为替代碳源是发酵工业的发展趋势之一．木糖是自然界中含量仅次于葡萄糖的单糖，木糖基的含量在木质纤维素中达 18%～30%，占总糖类的 30%～50%[1]．半纤维素水解液中木糖含量可以达到可发酵总糖的 90%以上[2]．因此，木糖发酵是综合高效利用木质纤维素水解液所必需的．

木糖代谢能够增加特定前体物的供应，有利于微生物发酵生产芳香族氨基酸、组氨酸和核苷、某些维生素及其衍生物．戊糖磷酸途径(HMP)是除糖酵解(EMP)外细胞内第二重要糖分解代谢途径，为细胞的合成代谢提供多种原料．微生物首先通过HMP途径来实现对木糖的代谢，木糖进入细菌细胞后，经木糖异构酶(xylose isomerase，XI)催化形成木酮糖，随后在木酮糖激酶的作用下形成木酮糖–5–磷酸，进入HMP途径．芳香族氨基酸的合成需要经过莽草酸途径，以来源于 HMP途径的赤藓糖–4–磷酸和来源于EMP的磷酸烯醇式丙酮酸作为共同初始底物[3]. 利用木糖除了容易生成赤藓糖–4–磷酸外，还可以减少PTS系统转运葡萄糖过程对磷酸烯醇式丙酮酸的消耗．Li等[4]构建的重组菌，以木糖与葡萄糖的混合糖为碳源，莽草酸产量比单独利用葡萄糖时要高．

自然界中绝大多数微生物以葡萄糖为碳源，不具备五碳糖(如木糖和阿拉伯糖)的代谢途径．半个多世纪以来，谷氨酸棒杆菌一直是重要的氨基酸和核苷生产菌，目前谷氨酸和赖氨酸的全球年产量分别高达250万吨和150万吨左右[5–6]．近年来，随着代谢工程和合成生物技术的发展，利用谷氨酸棒杆菌工程菌株可以生产越来越多的产品．然而，谷氨酸棒杆菌不具备完整的木糖代谢途径，其基因组上只含有木酮糖激酶编码基因．因此，需要引入异源木糖异构酶编码基因才能实现谷氨酸棒杆菌对木糖的利用．本研究首先克隆了多个外源木糖异构酶，通过质粒的形式在谷氨酸棒杆菌中过表达，菌株能够以木糖为唯一碳源进行生长．其次，对最优木糖异构酶表达质粒上核糖体结合位点进行替换，促进了菌株对木糖的利用能力．最后，对木糖表达元件进行了多拷贝基因组整合，实现了无质粒木糖代谢工程菌株的构建．

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

大肠杆菌(E.coli)DH5α、大肠杆菌(E.coli)MG1655、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)ATCC33913、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168、表达质粒 pXMJ19(CmR，tac启动子)和自杀型质粒pK18mobsacB(KmR)均为本实验室保藏．

1.2 培养基

LB 培养基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 5，pH 7.0，121℃灭菌 20min．固体培养基含 20g/L琼脂．

BHI培养基(g/L)：脑心浸提物 37，山梨醇 91，pH 7.0～7.2，121℃灭菌 20min．固体培养基含20g/L琼脂．

种子培养基(g/L)：BHI培养基，葡萄糖0.5．

发酵培养基(CGXⅡ，500mL)：(NH4)2SO45g，尿素 1 g，K2HPO40.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.125g，MOPS 21g，1% CaCl2溶液 500µL，VH溶液(1mgVH溶于1L蒸馏水)100µL，原儿茶酸溶液(3，4-二羟基苯甲酸300mg、10mol/L NaOH 1mL、蒸馏水 9 mL 混合)500µL，微量元素混合液(FeSO4·7H2O 1g，MnSO4·H2O 1g，ZnSO4·7H2O 0.1g，CuSO40.02g，NiCl2·6H2O 0.002g，用盐酸调 pH 至 1.0，蒸馏水补足 90mL)500µL，木糖 5g，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min．

1.3 培养方法

摇管培养：从-80℃甘油保菌管吸取20μL菌液接种于 BHI摇管，32℃、200r/min摇床培养 12～16h．

种子培养：将BHI摇管中培养的菌液以1%接种量接入装有 30mL种子培养基的三角瓶中，32℃、200r/min摇床培养8h．

发酵培养：待种子瓶 A600＝6～8时，以 4%接种量接入装有 50mL发酵培养基的三角瓶中，32℃、200r/min摇床培养．

1.4 菌株构建

根据 GenBank中大肠杆菌 MG1655、枯草芽胞杆菌 168和野油菜黄单胞菌 ATCC33913的木糖异构酶编码基因 xylA序列分别设计特异性引物，以各自基因组 DNA为模板，扩增xylA基因片段，回收纯化 PCR产物．双酶切(酶切位点见表 1)将 pXMJ19质粒线性化，利用 ClonExpress® Ⅱ One Step Cloning Kit(Vazyme)同源重组的方法分别连接4个xylA基因片段和线性化质粒片段，获得过表达质粒pXMJ19-xylAeco、pXMJ19-xylAbsu、pXMJ19-xylAxcc1和pXMJ19-xylAxcc2．采用类似方法构建 pXMJ19-SDGDH-xylAeco质粒，通过上游引物引入谷氨酸脱氢酶启动子的Shine-Dalgarno(SD)及周边序列．通过电转化方法将这些过表达质粒转入谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态细胞中，得到相应菌株．

表1 引物Tab. 1 Primers

以谷氨酸棒杆菌 ATCC13032基因组为模板，分别扩增上游、下游同源臂片段；以质粒 pXMJ19-SDGDH-xylAeco为模板扩增木糖异构酶 Ptac-SDGDH-xylAeco片段．PCR产物经纯化回收后，通过重叠PCR反应获得整合片段：上游同源臂＋Ptac＋xylA＋下游同源臂．通过同源重组方法连接到双酶切线性化的pK18mobsacB质粒上，获得整合质粒 pK18mobsacB-xylAeco．采用电转化将质粒 pK18mobsacB-xylAeco转化至谷氨酸棒杆菌 ATCC13032感受态细胞．将菌体涂布在含卡那霉素(10μg/mL)的 BHI平板上，于32℃培养 24～30h．待长出转化子后，挑取单菌落分别对点含卡那霉素和 15%蔗糖的平板，32℃培养16～20h．挑选表型正确(在卡那霉素平板生长良好而在蔗糖平板生长受到明显抑制)的菌落，进行菌落PCR鉴定，保存正确发生第一轮交换的菌株．将单交换菌株接种到含卡那霉素的 BHI摇管中培养 12～16h，再转接蔗糖摇管培养后，稀释 8～10万倍涂布蔗糖平板．将长出的单菌落分别对点蔗糖和卡那霉素平板，32℃培养 12～16h，挑选表型正确(在蔗糖平板生长良好而在卡那霉素平板生长受到明显抑制)的菌落，进行菌落PCR和测序验证，得到基因组整合菌株．

1.5 测定方法

菌体生物量测定：发酵过程中每隔 4h取样，利用分光光度计测定A600值．

残糖测定：取 500 μL发酵液于 1.5 mL离心管中，12000r/min离心 2min，取上清液稀释一定倍数后，经 0.22μm 膜过滤．用 SPD-20A 型岛津高效液相色谱仪测定木糖浓度，检测条件：色谱柱为 Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)，示差检测器，流动相 5mmol/L硫酸，流量 0.6mL/min，柱温30℃.

2 结果与讨论

2.1 不同来源木糖异构酶的质粒过表达

Kawaguchi等[7]最早在谷氨酸棒杆菌中构建了木糖代谢途径，在过表达来源于大肠杆菌的木糖异构酶(XI，由基因xylA编码)后，菌株能够以木糖为唯一碳源生长．随后，研究者们纷纷效仿该方法在谷氨酸棒杆菌中过表达大肠杆菌的 XI[8–9]．那么，其他细菌来源的 XI也值得研究．比如，野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)在葡萄糖存在的条件下能够稳定地代谢木糖[10]，其基因组上存在双拷贝 xylA，其中一个与木酮糖激酶编码基因 xylB形成基因簇，另一个独立存在，且碱基位点存在一些突变．那么可以设想，野油菜黄单胞菌是否在适应环境的过程中增加了一个 xylA拷贝，该基因上碱基变异是否有利于编码活性增强的XI．因此，本文分别克隆了野油菜黄单胞菌的两个xylA，同时克隆了枯草芽胞杆菌的和大肠杆菌的 xylA，构建了过表达质粒 pXMJ19-xylAxcc1、pXMJ19-xylAxcc2、pXMJ19-xylAbsu和 pXMJ19-xylAeco．将 4个质粒分别转化到谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032中，测定了菌株在以木糖为唯一碳源的基本培养基CGXII上的生长曲线(图1)．

图1 谷氨酸棒杆菌 ATCC13032质粒过表达不同来源xylA的生长曲线Fig. 1 Growth curve of xylA genes from different bacteria overexpressed in C. glutamicum ATCC13032

由图1可知，携带空质粒的菌株在木糖培养基中不能生长，出现A600值的小幅上升是由于接摇瓶培养时从种子液带入少量培养基．过表达野油菜黄单胞菌 xylA时 A600达到 1左右，且 xylAxcc1效果略好于xylAxcc2．过表达枯草芽胞杆菌xylA时菌株前10h生长慢于表达野油菜黄单胞菌 xylA，然而与后者相比，在 10h之后菌株仍然保持较快的生长速率，培养结束时 A600达到 1.38．过表达大肠杆菌 xylA时菌株生长速率最快，终A600值也最高，达到1.41．

由此可见，本研究中不同来源的 XI在谷氨酸棒杆菌 ATCC13032中均成功表达，pXMJ19质粒上xylA表达的启动子是来源于大肠杆菌的 tac强启动子．同样，Kawaguchi等[7]利用来源于pTrc99A的trc强启动子也实现了xylA在谷氨酸棒杆菌R菌株中的表达．然而，叶菁[11]利用 pEC-XK99E质粒(trc启动子)在谷氨酸棒杆菌 ATCC13032中表达 xylA失败，他认为可能的原因是trc启动子在谷氨酸棒杆菌中的活性较低，或者 pEC-XK99E在谷氨酸棒杆菌中的拷贝数较低．由图 1也可以看出，不同来源的 XI对谷氨酸棒杆菌利用木糖的影响较大，表达大肠杆菌 XI时木糖代谢水平最高．目前关于酿酒酵母利用木糖的报道较多，研究者们利用进化工程筛选到木糖代谢和/或乙醇发酵提高的菌株，通过分析发现进化菌株基因组上出现了多个拷贝的 xylA[12-14]．这些结果表明XI的活性对重组菌株利用木糖发挥至关重要的作用．从反应机理来看，XI可逆催化从木糖到木酮糖的异构化反应，反应平衡时木糖的转化率才达20%左右[15]．因此，为了增强谷氨酸棒杆菌的木糖利用能力，需要源源不断地高效表达XI．

2.2 tac启动子核糖体结合位点的替换

从图 1可知，虽然表达大肠杆菌 XI的谷氨酸棒杆菌利用木糖能力最强，但菌体生物量还较低，需要进一步强化 XI的表达．翻译起始的效率对基因表达水平具有重要影响，原核基因的表达是通过 mRNA 5′端 SD 序列与核糖体 30S亚基结合来起始的．SD序列与起始密码子的距离及之间的碱基组成对翻译效率影响显著[16]．谷氨酸棒杆菌一些基因缺少SD序列，也有SD序列接近或与起始密码子ATG重叠，这与大肠杆菌等其他细菌差别很大[17]．考虑到pXMJ19上tac启动子的SD序列与目的基因起始密码子之间的距离过远，本文在 xylAeco基因起始密码子前面添加了内源谷氨酸脱氢酶的 SD序列及周边碱基(图2)，构建了pXMJ19-SDGDH-xylAeco，旨在强化XI的翻译效率．因为野生型谷氨酸棒杆菌可以分泌高浓度的谷氨酸，其谷氨酸脱氢酶活性较高．携带 pXMJ19-xylAeco和 pXMJ19-SDGDH-xylAeco菌株在木糖基本培养基上的生长曲线如图3所示．

由图3可知，添加谷氨酸棒杆菌内源谷氨酸脱氢酶 SD序列后，菌株利用木糖生长速率明显加快，最终 A600达到 3.87，是对照组的 2.7倍．SDGDH的添加显著促进了xylAeco的mRNA的翻译．叶菁[11]利用pEC-XK99E的trc启动子在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中表达xylA失败后，采用谷氨酸棒杆菌内源基因groES的启动子及SD序列实现了xylA的成功表达．

图2 xylAeco表达的tac启动子序列分析Fig. 2 Promoter sequence analysis of tac driving xylAeco expression

图3 添加内源谷氨酸脱氢酶 SD序列表达 xylAeco对谷氨酸棒杆菌ATCC13032利用木糖的影响Fig. 3 Effect of SDGDH-added expression of xylAeco on xylose utilization by C. glutamicum ATCC13032

2.3 xylAeco在谷氨酸棒杆菌基因组上多拷贝整合

含质粒工程菌株在发酵过程中存在一定的问题，如质粒不稳定性和菌体生长变慢，目前工业生产菌株的构建多采用基因组整合的手段．因此，将上述研究确定的 Ptac-SDGDH-xylAeco表达元件分别进行了 1、2和 3个拷贝的基因组整合．对 3株无质粒菌株在木糖为唯一碳源的基本培养基中进行了摇瓶培养，生长曲线如图4所示．

图4 在谷氨酸棒杆菌基因组上分别整合 1、2和 3拷贝xylAeco菌株的生长曲线Fig. 4 Growth curves of C.glutamicum ATCC13032 with 1，2 or 3 copies of xylAeco integrated in its genome

随着 xylAeco整合拷贝数的增加，菌株利用木糖生长的生物量逐步提高，XI的酶活力与谷氨酸棒杆菌代谢木糖的能力呈正相关．然而，3拷贝菌株培养结束时 A600值为 2.93，与质粒过表达 xylAeco菌株相差较大．这说明xylAeco基因组整合的拷贝数还不够．

2.4 基因组整合和质粒表达xylAeco菌株消耗木糖的对比

为了更好地对比 3拷贝基因组整合与质粒过表达 xylAeco对谷氨酸棒杆菌利用木糖的差异，测定了两株菌培养过程中木糖的消耗(图 5)．由图 5可知，与菌体生长情况相吻合，3拷贝整合菌株木糖消耗速率要低于过表达菌株．尽管如此，还是成功构建了不含质粒的木糖代谢工程菌株，为今后开发利用木糖生产有用的化学品奠定了基础．

图5 xylAeco 3拷贝整合和质粒过表达菌株利用木糖生长和耗糖曲线Fig. 5 Curves of bacterial growth and xylose consumption by C.glutamicum ATCC13032 xylAeco×3 and C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-SDGDH-xylAeco

另外，也测试了工程菌株在葡萄糖和木糖混合碳源培养基上的生长和耗糖情况，结果表明，当葡萄糖存在时木糖几乎不被消耗．而单独利用木糖时，由于绕过了 HMP途径产还原力的氧化阶段，预期不会取得良好的发酵效果[18]．关于葡萄糖和木糖共利用的代谢特性和实际应用意义，在综述文章中已经进行了阐述[19]．目前正致力于通过基因工程手段构建可以同步利用两种糖的谷氨酸棒杆菌工程菌株．

3 结 论

在谷氨酸棒杆菌中过表达大肠杆菌、枯草芽胞杆菌和野油菜黄单胞菌来源的木糖异构酶编码基因xylA，成功构建了木糖代谢途径，其中大肠杆菌来源木糖异构酶的菌株利用木糖生长能力最强．通过在pXMJ19质粒tac启动子上添加谷氨酸棒杆菌内源谷氨酸脱氢酶的SD序列及周边碱基，提高木糖异构酶的翻译效率，菌株利用木糖的生物量提高到出发菌的2.7倍．同时通过多拷贝基因组整合xylA构建了无质粒木糖代谢菌株，但其木糖消耗和菌体生长能力低于质粒过表达菌株．由于木糖异构酶活性的高低是决定木糖代谢水平的关键因素，今后还需要优化 xylA表达的启动子及SD序列，同时利用新的基因组编辑技术实现更多拷贝数的基因整合，构建更加高效的谷氨酸棒杆菌木糖代谢工程菌株．