肺炎克雷伯氏菌漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

王建玲，桂 爽，付 禹，张妤彤，郑 东，路福平，刘逸寒

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，工业酶国家工程实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

漆酶(laccase，EC 1.10.3.2)，又称漆酚氧化酶、多铜氧化酶，是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶蛋白家族的一员[1–2]．漆酶的作用底物较为广泛，能够催化包括多酚类、二胺、芳胺类、羧酸类在内的250多种有机物发生氧化、聚合等反应．由于漆酶具有特殊的催化性能和宽泛的作用底物，因此其应用较为广泛，包括纺织业中的染料脱色、造纸工业中的生物漂白、食品行业中食品风味改良、检测酚类污染物生物传感器的构建和生物电子研发等[3–6]．部分上述工业过程需要在高温、强酸、强碱等恶劣条件下进行，因此，需要漆酶具有较好的温度和pH稳定性[7]．

漆酶主要存在于植物、真菌、少数昆虫和细菌中，其中真菌漆酶来源最为广泛，研究较为深入的真菌漆酶主要来自白腐真菌(C.thermophilium)[8]、射脉菌(Phlebia radiata)[9]、云芝栓孔菌(Trametes versicolor)[10]、鲜红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)[11]、糙皮侧耳(P.ostreatus)[12]、毛木耳(Auricularia polytricha)[13]和黑木耳(Auricularia auricula)[14]等．目前，关于真菌漆酶的研究众多，但其存在碱性条件下活性较低、热稳定性较差和丝状真菌生长周期长等缺点．细菌漆酶来源较少，目前已在生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)[15]、链霉菌(Streptomycetes)[16]、球形芽胞杆菌(Bacillus sphaericus)[17]、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)[18]、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)[19]及肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)[20]等细菌中发现过漆酶活性．与真菌来源漆酶相比，细菌漆酶在碱性条件下具有较好的催化活性和稳定性及存在 Cu2+抗性等优点[21–23]．以 2，6-DMP 为底物时，细菌漆酶的最适温度一般在 60～65℃，最适 pH 一般为 7.0～8.0，在 25～60℃和 pH 6.0～9.0范围内稳定性较好[24–27]．另外，黄俊等[20]筛选获得一株产漆酶菌 Klebsiella sp.601，以 2，6-DMP为底物时，该漆酶在 pH 5.0～8.0条件下较稳定，在 pH 3.0～4.0、pH 9.0～10.0条件下，几乎没有残余酶活力．本实验室前期从中国西双版纳土壤中筛选获得一株含漆酶基因(lac)的肺炎克雷伯氏菌[28]，lac基因与上述Klebsiella sp.601来源漆酶基因相比，共有18个不同氨基酸，该漆酶以2，6-DMP 为底物时，在pH 5.0～9.0条件下较稳定，在 pH 3.0～4.0、pH 10.0～11.0条件下，其残余酶活力在 20%以上，在 30～70℃条件下较稳定，其残余酶活力在40%以上，表明该漆酶具有良好的 pH和温度稳定性，但由于是在大肠杆菌中表达，难以实现高效合成．

本研究旨在通过构建前期筛选获得的具有良好酶学特性的 lac毕赤酵母重组菌株，实现该重组漆酶的高效分泌表达，为其应用奠定基础．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)TCCC111142、质粒 pUC57-lacm(根据毕赤酵母的密码子偏爱性优化的漆酶基因lacm克隆入pUC57中，由北京六合华大基因科技有限公司合成)、大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115、质粒pPIC9K均为本实验室保存．

1.1.2 主要试剂与工具酶

Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶 EcoRⅠ、NotⅠ，Takara公司；质粒快速提取试剂盒和 DNA 纯化回收试剂盒，Omega公司；蛋白胨和酵母浸粉，Oxoid公司；其他试剂均为国产分析纯．

1.1.3 培养基

LB固体培养基(g/L)：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，琼脂 15．

YPD 固体培养基(g/L)：酵母提取物 10，蛋白胨20，葡萄糖 20，琼脂 20．

BMGY 液体培养基(g/L)：酵母提取物 10，蛋白胨 20，YNB 13.4，甘油 5，生物素 0.04；1mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 6.0)100mL．

BMMY 液体培养基(g/L)：酵母提取物 10，蛋白胨20，YNB 13.4，加入生物素0.04；1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)100mL，每日补加甲醇5mL．

MD 培养基(g/L)：葡萄糖 20，琼脂 15，YNB 13.4，生物素 0.04．

1.2 方法

1.2.1 肺炎克雷伯氏菌漆酶基因扩增

通过NCBI基因库查找，根据已报道的肺炎克雷伯氏菌漆酶成熟肽基因，分析其保守序列，设计TCCC111142成熟肽编码基因的扩增引物，上游引物A-3′(下划线部分为加入的 EcoRⅠ酶切位点)，下游划线部分为加入的 NotⅠ酶切位点，双下划线部分为添加的6个组氨酸标签，方便纯化蛋白)．

以肺炎克雷伯氏菌基因组为模板，以 P1和 P2为引物，进行 PCR扩增．扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性 30s，55℃退火 45s，72℃延伸1min 40s，30个循环；72℃延伸 10min．

将 PCR扩增产物进行测序后，获得 lac基因序列，根据毕赤酵母的密码子偏爱性优化该基因，由北京六合华大基因科技有限公司进行合成，得到新型漆酶基因lacm．

1.2.2 重组质粒的构建

重组质粒pUC57-lacm和质粒pPIC9K经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切并纯化回收后，用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞中，经氨苄青霉素(Amp)抗性筛选，挑选阳性转化子；提取质粒，并进行酶切验证．

1.2.3 电转化毕赤酵母

提取重组菌质粒 pPIC9K-lacm，用 SacⅠ酶切线性化并进行纯化回收；制备毕赤酵母 GS115的感受态细胞；然后采用电转化法将线性化的重组质粒pPIC9K-lacm转化到毕赤酵母GS115，将电转液涂布于MD平板，30℃静置培养至转化子出现．

1.2.4 酵母转化子PCR鉴定

从 MD平板上挑选转化子提取基因组，以其基因组为模板，用上述lacm基因特异引物进行PCR反应，凝胶电泳检测 lacm基因是否插入到毕赤酵母GS115的染色体上．

1.2.5 漆酶在毕赤酵母中的诱导表达

选择 PCR鉴定为阳性的菌落 GS115/pPIC9K-lacm和转有空质粒的对照菌株 GS115/pPIC9K接种至 YPD 液体培养基中，30℃、220r/min培养 24h.以 3%的接种量转接到新鲜 BMGY培养基中，继续以 30℃、220r/min培养 24h，然后以 6000r/min离心 10min收集菌体，将菌体转接到 BMMY培养基中．再以 30℃、220r/min培养，并每隔 12h补加一次甲醇，使其终体积分数保持在0.5%，培养120h后可得到重组漆酶(rLACM)的粗酶液．

1.2.6 纯化rLACM

采用镍柱纯化亲和层析法纯化 rLACM，步骤如下：将含有 Ni树脂装入合适的纯化柱中，树脂体积为 2mL；用预冷的 Lysis Buffer缓冲溶液平衡树脂2～5个床体积；将平衡后的树脂与经过膜(0.22µm)过滤的粗酶液混合，在4℃条件下通过磁力搅拌器使二者结合 40～60min；将树脂与粗酶液的结合液过柱；加入预冷的 Wash Buffer缓冲溶液 20mL，进行清洗杂蛋白；用500mmol/L咪唑的Elution Buffer缓冲溶液5mL进行洗脱，用于SDS-PAGE检测目标蛋白的相对分子质量和纯度．

1.2.7 表达产物的SDS-PAGE分析

重组菌株 GS115/pPIC9K-lacm 和对照菌GS115/pPIC9K 在30℃诱导培养结束后，取1mL发酵液离心去除菌体，取上清液和纯化后 rLACM 各40μL进行SDS-PAGE分析．

1.2.8 漆酶活力测定及酶学性质考察

取 200µL的含 4mmol/L Cu2+的 0.1mol/L的柠檬酸–磷酸氢二钠缓冲液(pH 2～8)或者含 4mmol/L Cu2+的 0.05mol/L的甘氨酸–氢氧化钠缓冲液(pH 8.5～11)，于96孔板中，70℃保温1min．加入10µL的稀释适当倍数的纯酶液，混匀，70℃保温1min．再加入30µL的底物(8mmol/L的2，6-DMP)，混匀，记录反应初始吸光度和反应3min时吸光度．在一定的条件下，每分钟氧化1µmol的2，6-DMP所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)．

用pH 8.0的磷酸缓冲溶液配制漆酶的2，6-DMP底物，分别在20～100℃测定其酶活力，确定rLACM的最适温度．将酶液置于 pH 8.0缓冲液，在 30～80℃温浴，每隔 1h取样，在最适反应条件下测定其酶活力，考察其温度稳定性．

分别用pH为2.0～11.0的磷酸缓冲溶液配制漆酶底物 2，6-DMP，在 70℃反应下，确定 rLACM 的最适pH．将酶液置于pH 3.0～10.0缓冲液，于70℃保温35h，每隔5h测定rLACM酶活力，考察其pH稳定性．

2 结果与分析

2.1 重组质粒pPIC9K-lacm的构建

以肺炎克雷伯氏细菌的基因组为模板，以引物P1和P2扩增目的基因lac．在lac基因序列基础上，基于毕赤酵母密码子偏爱性，优化合成获得 lacm基因，与 lac相比，共改变 406个碱基，GC含量由61.3%变为 48.4%．重组质粒 pUC57-lacm与质粒pPIC9K均经 EcoRⅠ和 NotⅠ双酶切后连接，转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞中，经 Amp抗性筛选，挑选阳性转化子，提取质粒并进行酶切验证．如图 1所示，经过 EcoRⅠ和 NotⅠ双切，重组质粒产生约1600bp和 9300bp的两条带，与预计大小相符，证明重组质粒构建成功．

图1 重组质粒的酶切鉴定Fig. 1 Enzyme digestion idenfication of recombinant plasmid

2.2 重组质粒电转及转化子鉴定

将重组质粒 pPIC9K-lacm线性化后电转毕赤酵母GS115感受态，将电转液涂布于MD平板．从MD平板上挑选转化子，提取基因组，进行 PCR验证．如图2所示，得到一条约1600bp的条带，证明lacm插入到毕赤酵母染色体中，成功构建重组菌株GS115/pPIC9K-lacm．

图2 GS115/pPIC9K-lacm的PCR扩增结果Fig. 2 PCR amplification results of GS115/pPIC9K-lacm

2.3 rLACM的诱导表达及纯化

对照菌株 GS115/pPIC9K和重组菌 GS115/pPIC9K-lacm经甲醇诱导发酵 120h后，离心得到发酵上清液．以2，6-DMP为漆酶底物时，测得rLACM的酶活力达到 0.37U/mL，而嗜热栖热菌来源的热稳定性好的漆酶酶活力约为 0.022U/mL，嗜盐菌Chromohalobacter salexigens来源的漆酶活力达到0.14U/mL[25,29]．

对 rLACM 进行 SDS-PAGE分析，如图 3(a)所示，GS115/pPIC9K-lacm 与 GS115/pPIC9K 相比，在相对分子质量 5.8×104左右多出一条带，与预期rLACM 大小一致，以上说明 GS115/pPIC9K-lacm成功高效分泌表达rLACM．

如图 3(b)所示，使用镍柱亲和层析法纯化rLACM，并进行 SDS-PAGE分析，有一条单一条带，其相对分子质量约为 5.8×104，可用于后续的酶学性质研究．

图3 rLACM的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the rLACM

2.4 rLACM的酶学性质

2.4.1 rLACM的最适温度和温度稳定性

rLACM 的最适温度和温度稳定性如图 4所示．rLACM 的最适反应温度为 70℃，在 30～90℃范围内具有酶活性．对 rLACM 的热稳定性进行分析，其在30℃和40℃条件下保温5h，酶活力可维持在 95%左右；在 50℃和 60℃条件下保温 5h，酶活力仍在 50%以上；在 80℃条件下保温 1h，残余活力为25%左右．

图4 rLACM的最适温度和温度稳定性Fig. 4 Optimum temperature and thermostability for rLACM

由此可见，rLACM 的热稳定性能比真菌中的米曲霉(Aspergillus oryzae)以及细菌中的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的漆酶热稳定性能更加稳定[30-31]．另外，黄俊等[20]报道的肺炎克雷伯氏菌 601(Klebsiella sp.601)来源漆酶在 80℃处理 30min，则完全失活；而 rLACM 在 80℃条件下保温 1h，残余活力为 25%左右．这表明 rLACM 具有较好的热稳定性．

2.4.2 rLACM的最适pH和pH稳定性

rLACM的最适 pH和 pH稳定性如图 5所示．rLACM的最适pH为8.0，在pH 7.0～9.0的范围内具有酶活性．对 rLACM 的 pH稳定性进行分析，其在pH 7.0和pH 8.0的条件下保温35h，其残余活力在70%以上．在pH 5.0和pH 6.0以及pH 8.0和pH 9.0的条件下保温20h，其残余活力在60%以上，而黄俊等[20]报道 Klebsiella sp.601来源漆酶在 pH 8.0和 pH 9.0条件下保温 24h残余酶活力分别为55%和10%左右．此外，在pH 4.0、pH 10.0的条件下保温20h，其残余活力仍分别保持在41%和35%．该结果表明，rLACM具有较宽的pH稳定范围．

图5 rLACM的最适pH和pH稳定性Fig. 5 Optimum pH and pH stability for rLACM

由上述研究表明，rLACM 与目前报道的细菌来源漆酶相比，兼具较好的热稳定性及较宽的 pH稳定范围；同时，经在毕赤酵母中表达 lacm基因获得的rLACM，其酶学性质与在大肠杆菌中表达的重组漆酶[24]相似，说明表达宿主的改变并未影响漆酶的特性，从而可以通过毕赤酵母表达系统制备该性能优良的rLACM．

3 结 语

本研究以肺炎克雷伯氏菌的基因组为模板，通过PCR扩增得到其漆酶基因 lac，基于毕赤酵母密码子偏爱性优化后得到新型漆酶基因 lacm，并成功构建重组菌株 GS115/pPIC9K-lacm，以 2，6-DMP为底物，发酵液中的酶活力达到 0.37U/mL，实现肺炎克雷伯氏菌漆酶的高效分泌表达．经酶学性质分析表明，以 2，6-DMP为底物时，rLACM 的最适温度为70℃，最适pH为8；在30～70℃、pH 5.0～9.0活力稳定．该rLACM表现出的良好的酶学特性为漆酶的应用奠定了基础．