抗体亲和肽配基的高通量筛选和理性设计

刘夫锋，李 丽

(1. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2. 天津科技大学海洋与环境学院，天津 300457)

抗体又称免疫球蛋白，是由动物血液和组织液中B淋巴细胞分泌的一种特殊的可溶性糖蛋白．抗体可与相应抗原进行高亲和性和特异性的结合，这一特性是抗体在生物技术和医疗领域广泛应用的理论基础．靶向性强、特异性高和毒副作用小等优点使得抗体已被广泛应用于自身免疫性疾病、癌症和眼科等多种疾病的治疗[1]．经过20余年的发展，抗体已成为最成功的医药之一[2]．抗体药物包括多种类型，如单克隆抗体、双特异性抗体、抗体片段和抗体偶联物等.而单克隆抗体是研究最为成熟及应用最为广泛的抗体药物．单克隆抗体指由单一 B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体．2017年药物销售额排行榜前 100名中，抗体药物占了 21名.表1列出了全球销售额占前10名的抗体药物．据不完全统计，2020年抗体的全球市场会超 1250亿美元[1,3]．

抗体含对称的四条多肽链．其中相对分子质量较小(2.5×104)的两条称为轻链，约含 250个残基；另外两条相对分子质量较大(5.0×104～7.5×104)的称为重链，含 450～550个残基．轻链和重链之间通过四对二硫键相连接形成 Y型结构(图 1)．抗体 N-末端序列变化较大，因此该区域被称为可变区，又称Fab片段．Fab片段是抗体与抗原结合的主要部位，其结合抗原的部位在 VL及 VH 功能区的可变区.相对 Fab、Fc片段在同一种属动物中是比较恒定的，且其不能与抗原结合，因此一般作为亲和配基的结合位点．目前，抗体分为 IgG、IgM、IgA、IgD 和 IgE五大类．其中IgG 是血清中主要的抗体成分，约占血清抗体的75%．IgG又进一步分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4这四个亚类．

表1 2017年全球销售额排名前10位的抗体药物的相关信息Tab. 1 Top 10 global sale antibodies in 2017

图1 单克隆抗体的结构示意图Fig. 1 Structure of a monoclonal antibody

由于抗体表达的复杂性以及医用抗体的高品质要求，抗体纯化已成为抗体生产过程的关键步骤之一[4-5]．目前，抗体纯化常用的分离方法主要有离子交换色谱、疏水作用色谱、凝胶过滤色谱和亲和色谱等[6-7]．其中亲和色谱因其对抗体的高特异性已成为抗体纯化最常用的色谱方法之一．亲和色谱利用固定化配基和目标抗体之间的特异性和可逆的亲和作用，从复杂的生物样品中分离纯化目标抗体．由于亲和配基仅能特异性结合目标抗体，因此亲和色谱具有非常高的选择性和纯化效率[8]．此外，亲和色谱还具有条件温和、操作简单和保证分离的蛋白质性质稳定的优点[9-11]，因此特别适用于含量少且稳定性低的抗体的分离[12-13]．

筛选和选择亲和配基是构建有效亲和色谱分离体系的先决条件[14]．一旦开发获得合适的亲和配基，利用亲和色谱技术一步就能够使目标抗体的粗提液提纯几百甚至上千倍．因此，开发合适的亲和配基是利用亲和色谱分离纯化抗体的首要问题．理想的抗体亲和配基应具有以下四个特点：与抗体有适当的亲和力，从而在吸附过程中特异地吸附目标抗体且在洗脱过程中易于解离；易于大规模制备和固定到色谱介质上；有足够的生物和化学稳定性，从而能够耐受亲和色谱的洗脱和再生等操作条件；不易被降解、不易脱落而污染抗体产品等．

随着亲和色谱技术在抗体分离纯化中的广泛应用，目前已开发出多种类型的亲和配基，如蛋白质、染料、过渡金属离子和短肽等[15]．抗体的蛋白质配基主要指自然界中存在的与抗体之间具有很高的亲和性和特异性(结合常数为 108～109L/mol)的蛋白质，如抗原、凝集素和细菌细胞壁的免疫结合蛋白质(如葡萄球菌蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白H和蛋白M)等[15-16]．虽然蛋白质配基有高特异性，但这些配基存在价格昂贵、吸附容量小、化学稳定性差和易生物降解等缺点而难以大规模重复使用[17]．与蛋白质配基相比，染料(如三嗪类和蒽醌等)和过渡金属离子(如Ni2+、Zn2+、Cu2+和 Co2+等)具有价格便宜、化学稳定性好且能够承受较苛刻的洗脱条件，但这些配基的选择性不高[18]，且通常有毒，这进一步限制了它们在抗体分离纯化中的应用[19]．

1986年 Geysen等[20]首次提出的亲和短肽配基能够弥补上述三类配基的缺点．肽配基指由少数几个关键氨基酸残基组成，且与目标蛋白之间存在较强的亲和作用力的短肽．因此，抗体的亲和短肽配基具有以下四个优点：与抗体之间有足够高的亲和性；具有较好的理化稳定性；由于是小分子质量的短肽，即使不慎脱落进入抗体产品中也不易引起免疫和中毒反应；短肽配基与抗体之间的亲和性适中，在洗脱过程中不需引入苛刻的洗脱条件，从而避免洗脱过程中抗体变性．但因自然界中与抗体具有较高亲和性的短肽数量有限，如何寻找高亲和性的多肽配基就成为制约利用亲和色谱技术纯化抗体的关键问题．本文结合作者的前期研究工作，简要综述了抗体亲和短肽配基的筛选、理性设计与应用方面的进展．

1 抗体亲和短肽配基的高通量筛选

由于自然界中的短肽含量很少，目前最常用的获取亲和短肽配基的方法就是从肽库中筛选．近年来，快速发展的组合化学、噬菌体展示和核糖体展示技术均为快速构建大容量肽库奠定了坚实的基础．同时，高通量快速筛选技术的发展也使从大容量肽库中筛选获得高亲和性肽配基成为了可能．利用目标抗体筛选相应的肽库，可以获得与该抗体有一定亲和力的短肽配基．

1.1 组合化学合成肽库筛选技术

组合化学合成肽库筛选技术是利用组合化学技术将氨基酸按随机组合方式进行酰胺反应，从而在短时间内就可获得含有所有可能氨基酸序列的多肽库[21].然后再用待分离的抗体为靶标，从上述组合化学合成肽库中筛选出与该目标抗体具有较高亲和性的短肽[22]．理论上利用组合化学合成技术可以非常容易地获得具有所有排列组合的短肽序列．因利用组合化学技术获得的短肽之间具有尽可能大的差异性和化学多样性，利用该技术来筛选短肽配基就引起了研究者的关注与重视，表2列出了部分应用组合化学肽库技术筛选获得的亲和短肽配基．Yang等[23]从线性六肽库中经过三轮筛选获得亲和短肽配基HWRGWV，并利用该配基从哺乳动物培养液中纯化获得人 IgG．为了提高合成效率同时降低筛选工作量，Frank[24]开发了单点多肽阵列合成技术来替代传统的固相和液相多肽合成技术，从而使高密度合成短肽成为现实．Sugita等[25]利用该技术筛选获得了鼠源和人源抗体的八肽配基NKFRGKYK和NARKFYKG，然后利用这些短肽配基从细胞培养液中分离获得了抗体．为了克服线性短肽易于被体外降解的缺点，一些稳定性较高的多聚肽段被开发出来用于抗体的亲和配基．例如，Fassina等[26-27]通过三轮筛选从组合肽库中获得一个多聚短肽配基(RTY)4K2KG. 然后利用固定化该配基的色谱柱纯化获得了不同来源的 IgG，并取得了良好的分离效果．

表2 应用组合化学肽库技术筛选获得的亲和短肽配基Tab. 2 Some peptide affinity ligands for antibody purification using combinatorial peptide library

1.2 噬菌体展示肽库筛选技术

噬菌体展示技术是近年发展起来的利用噬菌体表达外源基因的一项新技术[34-35]．该技术以噬菌体(如 M13、λ和 T4等)为载体，首先把化学合成的随机核苷酸序列与噬菌体外壳蛋白的基因相融合，然后再将对应于上述随机核苷酸序列的短肽展示于噬菌体表面．随后利用待分离的抗体分子为靶标，利用多轮筛选方法获得与该目标抗体具有较高亲和性的多肽，最后通过测序技术获得展示在噬菌体表面的与目标抗体具有较高亲和性的短肽序列(图2)[36]．综上所述，噬菌体展示技术是一种利用生物技术快速构建随机组合肽库的常用方法[37]．

图2 噬菌体展示肽库筛选多肽的流程Fig. 2 Screening of peptides with phage display peptide library

噬菌体展示技术的出现为获得亲和性高且性质稳定的多肽配基提供了相对简便和快速的筛选途径[38]. 国内外的研究者利用这一技术已成功获得多种短肽配基并且已经广泛用于抗体的亲和色谱分离[39]．表 3列出了应用噬菌体展示肽库技术筛选获得的部分亲和短肽配基．例如，Ehrlich等[40]利用噬菌体展示随机肽库技术建立了两个噬菌体库(七肽库和十二肽库)，以抗体的 Fc片段为靶标分别筛选了上述肽库，从 34亿个随机序列中获得了多肽EPIHRSTLTALL，合成后作为亲和配基分离获得了高纯度人 IgG 单克隆抗体．针对单克隆抗体 3-E7，Cwirla等[41]利用噬菌体展示技术经过三轮筛选得到了51个含酪氨酸的六肽配基．实验测得其中6个配基与目标蛋白质之间的结合常数在 0.35～8.3µmol/L之间．

表3 应用生物展示肽库技术筛选获得的亲和短肽配基Tab. 3 Some peptide affinity ligands for antibody purification using biological display technology

噬菌体展示肽库虽然已用于抗体亲和短肽配基的筛选，但该技术尚存在如下三个缺点：(1)DNA的转导效率直接限制了噬菌体展示肽库容量的上限为1010[50]；(2)噬菌体宿主细胞对多肽的种类也有一定的选择性，从而使一些性能良好的多肽因为对宿主生长不利或具有毒性而首先被排除；(3)一些多肽作为噬菌体外鞘蛋白的一部分时具有很高的亲和性. 但当把该多肽合成并固定化后，其亲和作用力会大大降低甚至完全消失[51]．

1.3 核糖体展示肽库筛选技术

核糖体展示肽库技术是另外一种利用生物技术构建体外肽库的方法[52]．由于该技术采用无细胞的转录、翻译和选择的方法，从而有效克服了噬菌体展示技术的上述缺点．图 3为利用核糖体展示肽库技术筛选亲和短肽配基的示意图．从图 3可以看出：首先通过聚合酶链反应扩增目的基因的 DNA文库(图3A)，同时加入T7启动子、核糖体结合位点和茎环结构，将其转录成 mRNA(图 3B)[53]．上述 DNA 文库可以利用化学合成的方法获得．将上述DNA文库在无细胞翻译系统中孵育，使目的基因的翻译肽链展示在核糖体表面，形成“mRNA-核糖体-多肽”三元复合物，构成核糖体展示的短肽库(图 3C)．然后采用常规的酶联免疫分析方法从混合物中筛选出与目标抗体具有较高亲和性短肽的核糖体三聚体(图3D)．最后通过调节溶液使核糖体三聚体解离而释放mRNA(图 3E)．后者经纯化后作为模板进行反转录聚合酶链反应得到富集DNA(图3A)．最后经过多轮展示和富集，将最终得到的 DNA进行测序分析即可确定与目标蛋白具有较高亲和性的短肽的氨基酸序列．

与噬菌体展示这一类的体内展示方法相比，核糖体展示技术具有建库简单、库容量大(高达 1013～1015)、分子多样性强、易于添加非天然氨基酸和短肽环化等优点[54-55]．由于核糖体展示技术没有选择压力的限制，从而可以大大提高该技术的库容量和分子多样性．利用该技术非常容易进行后续的体外重组和突变，以进一步提高活性．此外，利用该方法可筛选有细胞毒性的多肽[56]．例如，Yonezawa等[57]以单克隆抗体anti-FLAG M2为目标蛋白，筛选获得了高亲和性短肽FLAG．该研究表明核糖体展示能在一天内完成两轮筛选，且筛选周期更短，是一种快速筛选的有效方法．Lamla等[58]也采用同样方法从含 2×1013条序列的核糖体展示肽库中筛选链霉亲和素的亲和肽配基，所得到的九肽配基的解离常数为17nmol/L，其亲和力是已有九肽配基 Strep-tagⅠ和Strep-tagⅡ的1000倍以上．

图3 利用核糖体展示技术体外筛选高亲和性短肽配基的示意图Fig. 3 Screening high affinity short peptide ligands in vitro with ribosome display technology

2 抗体亲和短肽配基的理性设计

前述的组合化学合成肽库技术、噬菌体和核糖体展示技术的建立分别从化学和生物学的角度推动了组合库构建方法和筛选技术的迅速发展，使大容量肽库的快速构建和筛选成为可能，但利用这些筛选技术获得短肽配基均存在工作量大、筛选灵敏度差和容易遗漏等缺点．因此，利用计算机技术在抗体及其已有配基的三维结构基础上开发高效的亲和短肽配基就成为更加快速的获得高亲和性短肽配基的有效方法．利用分子模拟软件可以对短肽与目标蛋白之间的亲和性进行预测，从而能够提高合成短肽的命中率，减少短肽的合成数目，双向降低合成与筛选的成本，从而大大缩短开发周期．因此，借助于分子模拟技术，亲和短肽配基的理性设计整合了抗体的结构特异性和合成肽配基在稳定性方面的各种优点，为高亲和性肽配基的设计提供了一种全新思路．

近年来，计算机软硬件技术的高速发展使研究者能够从微观角度进一步认识蛋白质-肽配基之间的作用模式，以及结合过程中作用力和能量的变化，这些均为高亲和性肽配基的开发提供了一条新的途径.在现有的计算机软硬件技术基础上，近年来分子模拟软件得到了快速发展．基于先进的分子图形学技术，利用分子模拟技术能在三维水平上了解短肽的分子结构和各种重要的理化性质，如静电势和疏水性等与所期望的宏观性质、亲和性之间的定量关系．理性设计亲和短肽配基的研究历史虽然仅有十余年，但其发展对于亲和色谱技术在抗体分离纯化过程中的应用具有重要的意义．表 4列出了部分应用分子模拟技术理性设计获得的亲和短肽配基．目前常用的抗体短肽配基理性设计方法有：基于结构的理性设计方法、基于功能的理性设计方法和理性设计结合组合库技术方法．

表4 应用分子模拟技术理性设计获得的部分亲和短肽配基Tab. 4 Some peptide affinity ligands for antibody purification using molecular simulation method

2.1 基于结构的理性设计方法

基于结构的理性设计方法是在抗体三维结构的基础上，利用分子模拟软件虚拟筛选或开发获得与抗体具有较高亲和力的短肽配基．近年来，生物信息学、计算机软硬件技术和分子模拟技术的飞速发展为抗体功能和三维结构的解析提供了更为广阔的平台．截至2018年6月，已有3142个抗体的三维结构信息通过实验方法测得，这些信息都存储在蛋白质结构数据库(Protein Data Bank，PDB)(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中，供全世界的研究人员免费使用．这些抗体的三维结构为抗体短肽配基的理性设计提供了便利，使其成为更加快速地获得抗体高亲和性短肽配基的有效方法．基于目标抗体三维结构的理性设计方法一般包括以下步骤：

(1)通过蛋白质数据库下载或同源建模的方法获得目标抗体的三维结构信息．

(2)基于实验数据或分子模拟软件分析找到潜在的配基结合位点(基于抗体结构的特殊性，一般的抗体的配基结合位点为Fc片段)．

(3)下载或建立一个含有大量候选分子的短肽数据库．

(4)利用分子对接软件(FlexX、Dock和 Autodock等)对上述短肽库进行虚拟筛选，并利用打分函数评价各配基与目标抗体之间的亲和性，获得与目标抗体有较高亲和性的短肽配基．

(5)利用分子动力学模拟软件(Gromacs、Charmm和 Amber等)进一步验证上述虚拟筛选获得的短肽配基和抗体Fc片段之间的亲和性．

(6)然后利用分子显示分析软件评价所获得的配基和目标抗体之间的亲和性．

(7)最后利用亲和色谱实验来验证上述配基与目标蛋白质之间的亲和性．

利用基于目标抗体三维结构的理性设计方法筛选抗体亲和配基的研究已经取得了一定的研究成果．例如，Wang等[62]结合柔性分子对接和分子动力学模拟方法从含 128个短肽配基的肽库中筛选获得了人IgG的四肽配基YFRH．利用该配基从CHO细胞培养液中分离纯化获得纯度达 98%的单克隆抗体．Wei等[63]利用分子对接在 hIgG三维结构的基础上设计出三种新型的四肽配基 DWHW、CEWW 和HEYW；并利用DWHW配基从cMEM和CHO细胞培养液中分离获得高纯度的抗体 IgG．在蛋白 A结构的基础上，利用仿生设计方法构建了一个八肽库，然后依次利用半柔性分子对接、柔性分子对接和分子动力学模拟方法筛选获得了 FYWHCLDE配基，并利用固定化该配基的亲和色谱柱，从人血清中分离获得高纯度的人IgG[65]．

2.2 基于功能的理性设计方法

基于功能的理性设计方法是在自然界中存在的亲和作用体系的基础上，利用已知的配体或抑制剂的功能基团来设计新的亲和配基[66]．例如，通过研究目标蛋白的底物、抑制剂或辅酶的形状或物理化学性质，如疏水性、静电势等来设计一种与目标蛋白具有高亲和性的配基．若目标蛋白的活性部位所暴露的残基已知，也可以根据理化性质互补的原则，如锁钥模式；或引进一些特殊的功能基团来理性设计配基[67]．因此，基于功能的理性设计的实质是在经验知识的基础上模仿自然界中存在的配体．例如，苄脒基团常被用来作为配基来分离纯化胰蛋白酶类蛋白酶[68]．Platis等[69]以锁钥原理为基础，理性设计了人艾滋病毒单克隆抗体 2F5的亲和配基，同时利用亲和色谱实验证明了该配基与目标蛋白具有较高的亲和力．

利用基于功能的理性设计方法，理性设计肽配基有以下两种途径：一种途径是通过研究与目标抗体具有较高亲和性的蛋白质(如抗原、蛋白 A、蛋白 G 和蛋白 L等)的形状或理化性质(如疏水性和静电势)，设计与目标抗体具有高亲和性的配基；另一种途径是在目标抗体的活性部位所暴露残基的基础上，根据理化性质互补的原则或引进一些特殊的功能基团，理性设计短肽配基．因此，该方法的实质是在经验知识的基础上模仿自然界中存在的配体．例如，Palombo等[64]在蛋白 A结构的基础上设计获得了短肽配基TG19318，从腹水粗提液中分离获得 IgE．由于三嗪类基团与糖蛋白上的糖链部分有较强的亲和作用，因此基于三嗪类结构设计多种亲和配基用于抗体分离[70]．

2.3 结合理性设计和组合库技术的方法

理性设计的成功率虽然很高，但该方法必须依赖于蛋白质结构-功能之间关系的深入了解．由于目前很多目标抗体缺乏结构-功能的信息，从而大大限制了该方法在亲和肽配基设计方面的应用．组合库技术虽然可以不用考虑目标抗体的结构与功能，但是利用该方法需要建立大容量的短肽库和高效灵敏的筛选方法．基于上述方法的优缺点，结合理性设计和组合库技术的方法被广泛用于亲和短肽配基的筛选和设计[71]．该方法在组合库技术的基础上加入理性设计的元素，使库容量大大降低，从而极大降低后期的筛选工作量和筛选成本，同时能够提高筛选命中率．因此，与组合库筛选技术理性设计两种方法相比，基于目标抗体及其现有配体结构和功能的基础上更加高效．结合理性设计和组合库技术的配基筛选过程一般包括以下步骤：

(1)在抗体或其自然配基三维结构基础上选择合适的结合位点．

(2)利用分子模拟软件理性设计一些与目标蛋白结合位点的结构和理化性质互补的氨基酸片段．

(3)以这些氨基酸片段为先导利用组合库技术来合成一系列的候选化合物．

(4)以目标抗体为靶标筛选与其具有高亲和性的短肽配基．

(5)合成该配基，固定化后制得亲和层析柱，利用其来分离目标蛋白；若其分离效果不佳，重复第(4)步进行重新筛选．

首先利用计算机的分子模拟技术获得抗体或其自然配基的尽可能详尽的结构信息，把合成的注意力更多地集中在具有相关结构或化学特性的潜在短肽配基上，以此构成一个小规模的短肽配基库用于实验筛选，研究人员可以从中获得亲和性较高的短肽配基；同时，通过分析筛选结果与短肽配基结构的定性关系获得一些更为直观的经验，用于指导短肽配基化合物的结构优化．由于单纯的规模化筛选目的性不强，筛选结果很大程度上取决于所建肽库的容量和质量；而单纯的计算机辅助的设计过程不能将随后的短肽配基固定化过程以及复杂的化学环境、动态的结合模式等诸多可变因素考虑在内[26]．目标蛋白的结构和功能信息与组合短肽配体库和高效筛选方法的结合，在很大程度上弥合了经验与实际过程之间的偏差，这种设计思路将对亲和色谱的规模化应用产生积极的影响．

2005年，Roque等[72]首先利用分子模拟工具分析了蛋白 L和人抗体轻链之间的相互作用，利用理性设计的方法获得了与抗体或其小片段(Fab或scFv)具有亲和作用的12个先导化合物分子，然后利用固相合成技术生成一个化合物库，通过筛选获得与目标蛋白具有高亲和性的化合物．合成并固定化该化合物制得亲和层析柱，用于人免疫球蛋白 G木瓜蛋白酶消化液中 Fab的分离纯化，纯度达到 96%～98%．

由于线性短肽易于被蛋白酶降解，尤其是利用亲和短肽配基从动物血浆等含有多种蛋白酶的样品中分离纯化抗体，该问题更加严重．虽然通过添加一些蛋白酶抑制剂能缓解该问题，但由于这些抑制剂价格较贵且后期需要从抗体中进一步去除，这都会提高抗体生产的成本．因此，将易于被蛋白酶降解的线性肽改造成含有非天然氨基酸或拟肽可以有效解决上述问题．环形肽具有非常好的稳定性和抗蛋白酶解的能力，已被广泛用作抗体的亲和配基．Dias等[49]基于组合肽库和理性设计方法在 Fc-Ⅲ的 N-和 C-端引入D-Pro-L-Pro得到 FcBP-2环肽，从而形成双环的结构．结果表明，FcBP-2与IgG的亲和性提高80倍以上．但由于 D-Pro不能固定化到介质上，因此 N-和C-端环化不能用于固相多肽合成，从而制约其工业化应用．为了克服上述缺点，Gong等[73]在FcBP-2结构基础上利用一个二硫键来替代 D-Pro-L-Pro，获得环肽 Fc-Ⅲ-4C(氨基酸序列为 DCAWHLGELVWCT)．结果表明，利用Fc-Ⅲ-4C与IgG的亲和性比Fc-Ⅲ提高30倍以上．

3 总结和展望

抗体在治疗炎症、肿瘤和传染类疾病等方面应用广泛．由于抗体表达技术的快速发展，下游的分离纯化已成为整个生产过程的关键步骤．由于具有高选择性和高特异性等优点，亲和色谱技术是工业制备高纯度抗体的主要手段之一．目前亲和色谱技术的应用瓶颈在于缺少合适的亲和配基．由于短肽配基具有较高的结构稳定性、易于从抗体产品中分离、与抗体的作用条件温和从而避免目标抗体的变性等优点，亲和短肽配基已广泛用于抗体分离纯化．

近年来，随着蛋白质结构解析技术(如晶体衍射、核磁共振和低温电镜技术等)的快速发展，越来越多的抗体及其复合物的三维结构被解析，亲和短肽配基理性设计技术得到了广泛应用．但是该技术目前尚有一些关键问题亟待解决．

首先，短肽配基与目标抗体之间亲和作用力的精确计算．目前主要使用分子对接方法来筛选与目标抗体有较高亲和性的短肽配基，因此虚拟筛选的效率与所用分子对接所用打分函数的准确性密切相关.只有准确判定短肽配基与目标抗体之间的亲和性，才能大大提高虚拟筛选的成功率．现有分子对接软件大多采用经验性力场来预测短肽与目标抗体之间的亲和作用力，而目前的经验性力场的准确度有待提高，因此如何准确判定短肽配基与目标抗体之间的亲和性是制约短肽配基理性设计发展的主要问题之一．目前已开发出一些方法，如自由能微扰和分子力学-帕松波尔茨曼表面积计算等[74]用于计算抗体-短肽配基之间的结合自由能，并获得了比较精确的结果.

其次，分子模拟过程中对抗体柔性的处理．现有的绝大多数分子对接软件仅考虑配基的柔性，而将抗体看成刚性的；而实际的短肽-抗体结合和解离过程中，短肽和抗体均是柔性的．因此，这种近似处理在一定程度上会给基于分子对接方法的理性设计造成很大的误差．虽然已有研究将分子动力学模拟和分子对接结合起来实现在对接过程中同时考虑配基和受体的柔性[75-76]，但由于分子动力学模拟的计算量较大，从而仅使用该方法不利于大规模筛选短肽配基[77]．将蛋白质-蛋白质对接技术(如 HADDOCK软件[78])以及基于此技术开发的相应的打分函数(dMMPBSA[79])应用于短肽配基-抗体之间的亲和作用力评价会极大解决上述问题．

由于现有分子模拟技术存在上述问题，因此目前理性设计的亲和肽配基的成功率仍然较低．例如，本研究室开发的仿生设计方法设计获得的15个短肽配基．利用亲和色谱实验证明只有 5个短肽能够作为配基用于抗体的分离，另外 10条短肽配基与抗体之间的亲和力比较弱，所以不能直接用于抗体的亲和分离[80]．因此，单纯利用分子模拟来设计亲和短肽配基的成功率还比较低．但随着计算机软硬件技术的进一步发展，尤其是分子模拟基本原理的飞速发展，分子模拟现存的上述问题将逐步得到解决，理性设计作为一种新兴的技术，必将在亲和肽配基的开发方面应用得越来越广泛，从而为抗体产业的发展贡献更多的力量．