一起鸡传染性鼻炎的诊断

王丽辉，张永欣

（1.重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2.天津瑞普生物技术股份有限公司，天津 300300）

鸡传染性鼻炎是由副鸡禽杆菌引起的一种急性上呼吸道传染病，临床症状主要以感染后肿头、流鼻涕及鼻窦发炎为特征，引起蛋鸡产蛋率下降及育成鸡和肉鸡生长不良和淘汰率增加，严重影响鸡只的生产性能[1-4]。副鸡禽杆菌的易感日龄主要分为育成阶段和产蛋阶段，7～18周龄感染后主要引起鸡只生长不良，在产蛋阶段感染后会导致产蛋率下降30%～50%，给养鸡业造成较大的经济损失，该病由于传播快，易于造成混合感染，而受到当前规模化、集约化养禽业的普遍重视[5]。根据美国学者Page1962年的分类方法，将副鸡禽杆菌分为A、B、C 3个血清型，不同血清型之间免疫关系相距较远，B型菌的免疫保护具有一定的型特异性[6-7]。

本试验自重庆某鸡场的部分发病鸡中，经临床诊断为鸡传染性鼻炎，对病鸡的眶下窦进行细菌培养和PCR诊断，确诊为鸡传染性鼻炎。我国于1986年首次在北京分离到副鸡禽杆菌，而后陆续在不同省、市、区分离到副鸡禽杆菌，经鉴定均为Page A型；Page C型副鸡禽杆菌在我国曾有过报道，但分离菌株并没有保存下来；2003年张培君等从辽宁某鸡场分离到1株B型副鸡禽杆菌，这是我国首次报道的由Page B型引起的鸡传染性鼻炎[8-12]。鸡传染性鼻炎在我国不同地区均有发生，流行毒株也有地域差异，不同地区报道的疾病的发生，对当地的疾病防控具有重大的意义[13-14]。

1 试验材料

1.1 病料来源

病鸡来源于重庆某鸡场，病鸡表现为肿头、眼角有泪痂、流涕，精神不振，不喜食，具有鸡传染性鼻炎的典型症状。

1.2 试剂

含辅酶I的鸡肉汤琼脂平板、全血平板、革兰氏染色液等，均为自制；dNTP、PCR bufer、Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL1000、均购自生工生物工程（上海）有限公司；其他试剂，均为分析纯。

1.3 PBS

称 取 NaCl 6.0 g、 Na2HPO41.757 g、NaH2PO40.709 g，溶于1 000 mL水中，溶解后用10%NaOH调pH至6.9～7.1，121℃高压灭菌15 min，室温保存，备用。

2 试验方法

2.1 培养基配制

鸡肉汤的制备：取鸡胸脯肉泥1份加纯化水2份，在2～8℃浸泡过夜，煮沸30 min，除去肉渣，澄清过滤。

鸡肉汤培养基的制备：取多聚蛋白胨5 g、酪蛋白氨基酸5 g、氯化钠5 g和鸡肉汤100 mL，加入纯化水至1 000 mL，调pH至7.4。经121℃高压蒸汽灭菌15 min并冷却至40℃以下，加入终浓度2%灭活的鸡血清和10 μg·mL-1NAD用于细菌培养。

鸡肉汤琼脂培养基的制备：称取多聚蛋白胨1 g、酪蛋白氨基酸1 g和NaCl 1 g，用200 mL鸡肉汤溶解后，使用10%氢氧化钠调pH至7.3～7.4，然后加琼脂3.6 g使其完全溶解。经121℃高压灭菌15 min，取出后降温至约60℃，加入10 mL鸡血清和终浓度10 μg·mL-1NAD，混匀后制备培养平板或斜面备用。

2.2 发病情况

2018年，来源于重庆某鸡场100～130日龄商品育成鸡发生多起以头部肿胀、流泪为主要临床症状的病例，病初仅有少数鸡群发病，几天后就迅速蔓延至所有鸡群，个别鸡只出现死亡，严重影响鸡的生长发育，给鸡场带来巨大的经济损失。

2.3 细菌的分离培养

将疑似鸡传染性鼻炎症状的病鸡头，用无菌手术刀片切开眶下窦，用棉拭子沾取眶下窦内容物，接种于血平板，于37℃培养箱中培养48 h后观察菌落。若出现疑似的单个菌落，进行纯化培养。挑取单个菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌的形态特征；同时在含NAD的鸡血清鸡肉汤琼脂平板上划线，挑取单个可疑菌落接种到含血清的鸡肉汤中进行纯培养，同时进行下一步的鉴定。

2.4 形态特征

参照中华人民共和国农业行业标准NY/T 538-2002鸡传染性鼻炎诊断技术方法，对可疑病料进行副鸡禽杆菌的分离。用棉拭子在无NAD的鸡血清鸡肉汤琼脂上划5～7条横线，然后再用产NAD表皮葡萄球菌划一竖线，翻转平皿置37℃5%CO2培养箱培养18～20 h，观察疑似菌落是否出现卫星现象，并挑取典型菌落进行过氧化氢酶试验。

2.5 PCR鉴定

2.5.1 PCR菌落样品制备

挑取平皿上的可疑菌落，加到含10 μL水的0.2 mL小离心管中，压紧管盖，95℃加热10 min，再冰浴10 min后进行PCR扩增或-20℃保存。

2.5.2 PCR阴阳性对照样品制备

用10μL水作为阴性对照样品，用9 μL水加1 μL已知阳性对照物作为阳性对照样品。95℃10 min，再冰浴10 min后进行PCR扩增或置-20℃保存。

2.5.3 引物设计

参照中华人民共和国农业行业标准NY/T 538-2002鸡传染性鼻炎诊断技术方法根据16srRNA设计鉴定副鸡禽杆菌鉴定引物，扩增全长为527 bp。上游为5'-TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT-3'，下游为5'-CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT-3'。

2.5.4 PCR扩增

参照NY/T 538-2002鸡传染性鼻炎诊断技术方法，将样品管5 000 r·min-1离心5 min，吸上清做DNA模版，配制25 μL反应体系。再瞬时离心，置PCR仪上进行扩增反应。PCR反应程序为：94℃10 min；94℃30 s，65℃30 s，72℃ 1 min，循环34次，72℃延伸10 min。

2.5.5 琼脂糖凝胶电泳

待PCR反应结束后，每个PCR样品取5 μL于含0.5 μg·mL-1EB的2.0%琼脂糖凝胶孔中电泳，同时加入5 μL的1 000 bp的Mark作为参照，在120 V恒压电泳中20 min，取凝胶置紫外成像仪观察。

2.5.6 结果判定与表示方法

阳性对照样品应在500 bp附近呈现一条目的条带，阴性对照样品无条带。被检样品若出现与阳性对照同样大小的一条目的条带，则判为阳性，记作“+”，若无条带，则判为阴性，记为“-”。

2.6 动物回归实验

挑取将可疑菌落，接种到含血清的鸡肉汤中进行纯培养，摇床160 r·min-1，培养18 h，取新鲜的鸡肉汤培养物0.5 mL，眶下窦接种30日龄SPF鸡5只，接种后逐日进行10日临床观察，并记录结果。

3 试验结果

3.1 发病情况

病鸡主要表现为眼睑肿胀、鼻道和鼻窦有粘液性分泌物流出等上呼吸道症状。发病初病鸡精神沉郁，垂头缩颈，鼻孔流出稀薄水样鼻液，3～5 d后转变为黏液性分泌物。眼结膜发炎，流泪，一侧或两侧眼眶周围组织水肿，发病后，鸡群采食量明显下降。

3.2 细菌分离情况

病鸡眶下窦内分泌物在鸡血清鸡肉汤琼脂平板上为露滴状菌落，在普通肉汤和普通琼脂平板上不生长，挑取菌落图片，革兰氏染色镜检可见为两级浓染的阴性短杆状，在辅酶Ⅰ的肉汤琼脂上和全血平板上生长灰白色、边缘整齐、表面光滑、有轻度隆起、黏液状、湿润、有光泽、不透明的菌落。

3.3 卫星现象

分离物在接种有表皮葡萄球菌的鸡血清鸡肉汤琼脂平板上呈现出明显的“卫星现象”，即越靠近葡萄球菌的周围其生长越好，且过氧化氢酶阴性，初步判定为疑似副鸡禽杆菌疑似菌落。

3.4 PCR鉴定

根据上述生化鉴定结果，用针对副鸡禽杆菌16sRNA设计的引物，对该菌进行PCR鉴定，可得到大小为0.5 kb的片段，与阳性样品一致，而阴性样品中无该片段的条带。通过PCR方法检测，验证其为副鸡禽杆菌，结果见附图。

3.5 动物回归实验

取可疑菌落制备成菌悬液，取0.2 mL接种30日龄SPF鸡眶下窦，接种鸡在8 h后即可见到流鼻涕，肿头等典型的鼻炎症状，临床观察记录结果见附表。接种48 h后，所有鸡均开始出现典型的鼻炎症状即攻毒一侧眶下窦及周围肿胀，鼻部有鼻涕或结痂，在攻毒第3～5天最为严重，随后不再有新发病例出现，在9 d后所有病例逐渐好转。

附图 PCR鉴定结果

附表 SPF鸡攻毒结果

4 治疗和预防

4.1 治疗

对发病鸡只进行隔离治疗，使用消毒剂进行带鸡消毒，连续消毒5 d，土霉素按使用说明书2～3倍量饮水治疗。未发病的鸡群，紧急接种鸡传染性鼻炎疫苗。

4.2 预防

4.2.1 疫苗接种

科学的预防接种免疫，是防治本病的关键措施，可根据近年来鸡场附近的流行毒株选用适用的疫苗，进行科学的免疫程序。鸡传染性鼻炎有A、B、C 3个血清型，不同血清型之间的无交叉免疫保护，因此在免疫时应考虑使用A、B、C型三价疫苗来进行免疫，通常在4～6周龄免疫1次，间隔10周，进行第2次免疫。

4.2.2 科学的饲养管理

加强饲养管理，提高饲养条件，有通风保障，调控饲养密度适应饲养周期；一旦发病，立即隔离治疗发病鸡，对未发病鸡进行带鸡消毒；对曾发本病的鸡舍，进雏前应进行彻底的清洗和消毒，并应空舍1～2周，再重新进鸡；本病易与大肠杆菌等病混合感染可引起病鸡死亡，病程较长，反复发生，难以净化，应采用全进全出的鸡群饲养管理办法，可有效地减少本病的发生；不同的饲养周期选用合理的饲料配方，增加矿物元素和维生素，提高鸡群的免疫力；对进出场区的人员、车辆、物品进行消毒后，才能准入，严禁人员串舍，切断病毒传播几率。

5 小 结

该鸡场由于在产蛋前未接种过鸡传染性鼻炎疫苗，产蛋后由于温度变化，导致鸡群应激，引起呼吸道症状，进而伴随其他呼吸道疾病的继发感染，使疫情变得复杂。可依据临床表现和剖检进行初步诊断，进一步需用RT-PCR进行诊断，该饲养场在发现病情确诊后，紧急进行鸡传染性鼻炎疫苗的预防接种，在短时间内缓解了病情。对鸡传染性鼻炎的防治要进行科学的疫苗接种和饲养管理，才能提高养殖的经济效益。