基于便携式荧光定量PCR仪的兔病毒性出血症病毒现场检测方法的建立及应用

李天芝，于新友

（山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600）

兔病毒性出血症病毒（RHDV）仅能感染兔，引起兔病毒性出血症（RHD），该病是兔常见的一种烈性、高度传染致死性疾病[1]。临床表现主要为呼吸系统出血，实质器官淤血、肿大、出血和肝坏死，是危害养兔业最严重的疾病之一[2]。主要危害2月龄以上兔，潜伏期短、发病急、病程短，各品种兔均可感染发病，传播速度快，发病率和死亡率高，可达90%，给养兔业造成了严重的经济损失。病兔和带毒兔是主要传染源，主要通过呼吸道、消化道等直接接触方式传播。1984年首先在我国江苏省首先发生该病，随后在世界各地均有相关报道[3]。OIE将该病列为B类传染病，我国将其列为二类传染病。

兔病毒性出血症病毒其病毒粒子为球形，直径大小为32～36 nm，无囊膜，二十面体立体对称，为单股正链RNA病毒，基因组全长7 437个核苷酸。对外界环境抵抗力强，对乙醚、氯仿和PH3有抵抗力。病毒基因组变异速度慢，可能因兔子一般发病急，病程短有关。2010年法国首先报道了一种新型变异性兔瘟病毒称为RHDV2或RHDVb，其基因序列与RHDV具有82.4%的同源性。目前，已在西班牙、德国、葡萄牙等多个国家爆发流行，引起的病变与经典兔瘟类似，但是能感染致死30日龄以内的兔和一些野兔品种，传统灭活疫苗效果不理想[4]。目前我国尚无RHDV2发病的相关报道，但是随着国际交流合作的不断深入，该病传入我国的风险不断增加。

当前实验室检测RHDV包括病毒的分离，血凝实验、ELISA实验、RT-PCR等，这些方法都存在着各种弊端，或操作繁琐、时间长，或敏感性低，或不能进行早期快速确诊[5-6]。

荧光定量PCR技术经过20多年发展已经成熟，SYBR GreenⅠ染料法与TaqMan探针法相比，特异性太差，不适合临床检测[7-9]。探针法荧光PCR检测已经广泛应用于各种疾病早期快速确诊，但关于RHDV荧光PCR检测相关研究报道较少。基于此，本试验建立了RHDV一步法荧光PCR快速检测方法，应用于临床，可实现RHD早期快速确诊，从而采取相应措施，减少养殖场损失。

1 材料与方法

1.1 病毒株与病料

兔病毒性出血症病毒（RHDV）、兔巴氏杆菌、兔大肠杆菌、兔沙门氏菌、兔水疱性口炎病毒（RVSTV）和兔轮状病毒（RRV）等均为本实验室贮存，临床检测样品为从山东各地兔场疑似RHDV感染的兔肝。

1.2 试剂和试剂盒

PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit Ver.2 为大连宝生物公司产品，细菌基因组DNA提取试剂盒购自百泰克生物技术有限公司，AxyPrep病毒基因组提取试剂盒为杭州爱思进生物公司产品。

1.3 引物和探针

据GenBank公布的RHDV基因序列，设计两条引物和1条TaqMan水解探针，引物和探针序列如下：RHDV-F1：5'-TACTTTACACCGTCCAACATT CT-3'和 RHDV-R1： 5'-AACCAACCGCCCACCAAA-3'，特异性探针为P1：5'-GCCGTGCTGAGCCAGAT GTATGCTG-3'，其中探针荧光基团标记的为FAM，淬灭基团标记的为BHQ1，引物和探针均由生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 病毒核酸的提取

参照AxyPrep病毒基因组提取试剂盒说明书，分别提取RHDV、RVSTV和RRV等核酸作为模板。同时用细菌基因组DNA提取试剂盒提取兔常见细菌如兔巴氏杆菌、兔大肠杆菌、兔沙门氏菌的核酸作为模板。

1.5 荧光PCR检测方法

荧光PCR反应体系总体积为20 μL，其中2×1 Step Buffer 10 μL，PrimeScript™ 1 Step Enzyme Mix 0.8 μL，模板2 μL，浓度为10 μmol·L-1的引物，浓度为5 μmol·L-1的探针的加入量进行适度调整，最后纯化水补充总体积为20 μL，瞬时离心后，置便携式荧光PCR仪MyGo mini中，分别以53、54、55、56、57、58、59、60℃等不同的退火温度进行扩增反应，选取能获取低的CT和较高的荧光强度增加值的退火温度和引物及探针浓度做荧光PCR反应最适条件[10]。

1.6 敏感性实验

按李天芝等方法测定RHDV组织毒的LD50[11]。10倍系列梯度稀释7次后，即10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取 RHDV 组织毒原液及稀释后7种病毒液100 μL，按照病毒基因组提取试剂盒说明书操作，分别提取RHDV核酸，作为模板，按优化后的程序及反应条件，分别扩增检测，以确定所建方法的敏感性。

1.7 特异性实验

分别以提取的RHDV、兔巴氏杆菌、兔大肠杆菌、兔沙门氏菌、RVSTV和RRV核酸作为模板，采用所建立的荧光PCR方法进行检测，以检验所建方法是否与兔常见病原有交叉反应。

1.8 重复性实验

取测定LD50的RHDV组织毒液3份，分别按1.6所述稀释，均取10-1、10-2、10-33种不同稀释度，分别提取核酸进行荧光检测，根据Ct值的不同，算出组内和组间变异系数，以检验所建方法的重复性是否良好。

1.9 临床样品检测

2018年8 月～2019年4月共从兔场收集疑似RHD病料样本89份，采用优化后PCR加样体系和扩增程序进行荧光PCR扩增反应，同时对病料样本采用普通RT-PCR方法进行检测，比较两种方法所得到的检测结果。

2 试验结果

2.1 荧光PCR检测方法

在反应程序固定不变的情况下，通过不断优化加样体系中引物和探针浓度，最终确定当总反应体系20 μL时，引物RHDV-F1加入量为1 μL，RHDV-R1加入量为1.2 μL，而探针加入量为0.8 μL，这样才能达到最好的扩增效果。保持引物和探针加入量不变的情况下，优化后的退火温度为55℃，即在此温度下能获得最低的Ct和高的荧光强度增加值。

2.2 敏感性实验

RHDV组织毒LD50测定结果为105.14LD50·100 μL-1，10倍系列梯度稀释7次后，即分别为104.14LD50·100μL-1、103.14LD50·100 μL-1、102.14LD50·100 μL-1、101.14LD50·100 μL-1、100.14LD50·100 μL-1、10-0.86LD50·100 μL-1、10-1.86LD50·100 μL-1，结果显示，100.14LD50·100 μL-1的梯度检测结果仍然为阳性，10-0.86LD50·100 μL-1、10-1.86LD50·100 μL-1则为阴性，说明该法检测限度为稀释为100.14LD50·100μL-1（1.38LD50·100 μL-1）的RHDV组织毒。

2.3 特异性检验

用所建方法分别检测兔病原核酸，结果显示仅样品RHDV，FAM荧光检测时出现单一S型扩增曲线，其余兔巴氏杆菌、兔大肠杆菌、兔沙门氏菌、RVSTV和RRV样本核酸检测结果均为阴性，说明方法特异性好。

2.4 荧光PCR重复性实验

3份RHDV组织毒液10-1、10-2、10-33种不同稀释梯度分别用建荧光PCR方法检测重复检验3次，根据所得Ct值，计算组内和组间变异系数，结果显示，变异系数＜1.5%，说明方法重复性好，见表1。

表1 实时荧光PCR的组内和组间重复性实验结果

2.5 临床样品检测

用所建荧光PCR检测方法及常规RT-PCR方法，同时检测临床疑似RHDV感染兔组织病料样本，结果显示，荧光PCR检出率高于常规RT-PCR，二者符合率为96.6%，检测结果如表2。

表2 两种方法临床样品检测结果

3 讨论

王波等建立了RHDV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法，结果表明，该法可检测到的模板的最低拷贝数为8.18×101copies，只能特异性扩增RHDV，pGM19-T-EBHSV、兔巴氏杆菌、兔沙门氏菌、兔大肠埃希菌和健康兔组织RNA的扩增均为阴性，具有良好的特异性和重复性[12]。蒙正群等根据公布的RHDV VP60基因保守序列设计2条引物和1条探针，优化条件后，建立了基于TaqMan探针的RHDV荧光定量PCR检测方法，该方法特异性好，对健康家兔组织cDNA、家兔巴氏杆菌、家兔沙门菌、家兔大肠杆菌核酸均无扩增，敏感性高，检测限度为2.8×101copies·μL-1的质粒标准品，通过对5种不同浓度标准品的3次重复性验证检测，表明方法具有很好的重复性，变异系数均≤2%[13]。

RHDV疑似临床病料检测时，首先需要提取RHDV核酸RNA。核酸提取的浓度和纯度影响检测结果的准确性，核酸提取时间影响检测反应总时长。目前RNA提取方法主要有TRIzol Reagen手提法、磁珠法提取试剂盒和柱式提取试剂盒3种，TRIzol手提法操作繁琐、时间长，适合实验室检测，对技术要求高，磁珠法提取试剂盒适合大量样本机器提取，相比之下柱式提取试剂盒适合临床样本的基层现场快速检测，因所需试剂可常温保存运输，配合小型离心机能迅速完成样本核酸提取[14-15]。

RHD是兔常见多发的一种烈性、病毒性传染病，该病发病急，传播迅速，可造成兔大量死亡，兔场发病后损失惨重[16-18]。目前，RHD无特效药物治疗，疫苗接种是一种有效的防控措施[19]。但于所选用厂家疫苗的质量问题、疫苗不合理的保存和运输、不科学的免疫程序及疫苗免疫前野毒的隐性感染等问题，常导致兔场RHD疫苗免疫失败而发病。高质量兔瘟疫苗免疫家兔3～5 d后即能起到一定的保护作用，减少死亡，降低养殖场损失。只有在发病早期尽早确诊，选用高质量疫苗免疫才能减少RHDV排毒，减轻兔症状，减少发病兔数量。而这些都有赖于疾病快速、准确的现场诊断。本试验所建立的方法配合商品化核酸柱式提取试剂盒和重量仅2 kg的便携式荧光PCR仪MyGo mini，非常适合现场快速检测RHDV，50 min可完成病料处理到结果分析的全过程，不需要特定试验室，不用开盖电泳检测反应产物，避免了对环境的气溶胶污染，较传统RT-PCR检测方法可节省至少一半时间，进一步降低了检测成本，可为养殖场挽回损失，但研究所需设计需冷冻保存和运输，对距离太远的边远地区来说仍然不方便，打算下一步研制适合常温保存和运输的PCR冻干试剂，使用时只需加入纯化水溶解，再加入模板即可，进一步简化操作，提高方法的实用性。