重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗（H5N1Re-11株、Re-12株+H7N9Re-2）对蛋鸡免疫效果抗体监测以及安全性试验评估

杨起贺，杨 浩，高 鹏，荣富龙，李叔伟

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150000）

1 材料与方法

1.1 供试材料

哈药集团生物疫苗有限公司重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗（H5N1Re-11株、Re-12株+H7N9Re-2）灭活疫苗。

抗体监测试剂：禽流感H5N1 Re-11株和Re-12以及H7N9Re-2株抗原及阳性血清，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供，1%红细胞悬液由哈药集团生物疫苗有限公司质量管理部提供的SPF级公鸡红细胞。

1.2 试验鸡群

黑龙江省哈尔滨市某蛋鸡养殖场，饲养量蛋鸡1 500只，正常免疫鸡群900只，300只不免疫重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗，300只做应激实验。

1.3 免疫剂量及方法

首免：15日龄，免疫剂量0.3 mL·羽-1，颈部皮下注射。二免：45日龄，免疫剂量0.5 mL·羽-1，肌肉注射。三免：75日龄，免疫剂量0.5 mL·羽-1，肌肉注射。四免：100日龄，免疫剂量0.5 mL·羽-1，肌肉注射。

1.4 血样采集

15日龄免疫前先测定基础抗体，然后于29日龄（首免后2周）、36日龄（首免后3周）、43日龄（首免后4周）、52日龄（二免后1周）、59日龄（二免后2周）、66日龄（二免后3周）、73日龄（二免后4周）、82日龄（三免后1周）、89日龄（三免后2周）、 97日龄（三免后3周）、104日龄（三免后4周）、111日龄（三免后5周）、117日龄（四免后1周），每次分别每组采集10份血样，离心制备血清并按照国家标准进行红细胞血凝抑制实验（HI）检测抗体。

1.5 检测试剂和检测方法

试验均用国家标准红细胞血凝抑制实验（HI）进行抗体检测，待检血清HI抗体滴度≥4log2时为抗体合格。

1.6 安全实验

首次免疫15日龄接种H5+H7亚型三价灭活疫苗后，每天测定鸡的体重。免疫接种后连续观察20 d，记录疫苗接种部位和全身反应。

1.7 应激实验

将300只鸡分为5组，每组60只，A组15日龄接种0.3 mL，B组15日龄接种0.5 mL，C组75日龄接种0.5 mL，D组75日龄接种0.8 mL，F组75日龄接种1 mL。接种后通过吸收时间，精神状态，采食量观察不同剂量H5+H7亚型三价灭活疫苗对鸡群的应激情况。

2 试验结果

2.1 免疫后各毒株抗体效长规律

免疫后各毒株抗体效长规律见表1。

表1 免疫后各毒株抗体效长规律

结果表明，蛋鸡开产前选择H5+H7亚型三价灭活疫苗进行3次免疫，首免15日龄，二免45日龄，三免75日龄，选择在不同日龄对鸡群进行抗体监测，首次免疫14 d后抗体滴度＞5 log2，59日龄也就是二免14日龄后，H5N1 Re-11、H5N1 Re-12、H7N9Re-2抗体滴度均＞8 log2，对鸡群有很好的保护作用。

2.2 接种疫苗后鸡体重变化

接种疫苗后鸡体重变化见表2。

结果表明，免疫组与对照组的体重基本保持一致，差异不显著（P＞0.05），疫苗的接种并不影响鸡的体重的增长。注射疫苗后疫苗接种组和没有接种疫苗组鸡群的精神状态无显著差异（P＞0.05），免疫鸡精神食欲良好，无不良反映，证明本疫苗是安全的。

2.3 应激实验

应激实验见表3。

结果表明，不同日龄的鸡群接种不同剂量的重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗（H5 N1Re-11株、Re-12株+H7N9Re-2），从完全吸收时间、精神状态、采食量方面来评价接种疫苗后对鸡群应激状况，接种最大剂量1 mL时，疫苗对鸡群应激影响是一过性的，2～3日龄可以恢复。由于是临床上饲养的鸡群，饲养管理、温度、湿度等都会对鸡群造成一定的影响，疫苗回温也会对应激产生影响，建议疫苗回温时间1.5～2 h。

表2 接种疫苗后鸡体重变化

表3 应激实验

3 讨论

3.1 抗体滴度消长规律

对于蛋鸡，本试验选择15、45、75日龄进行3次免疫，首次免疫后14日龄H5 Re-11、H5 Re-12、H7Re-2抗体滴度＞4log2，对鸡群有保护力，二次免疫后14日龄H5 Re-11、H5 Re-12、H7Re-2抗体滴度＞8log2，说明对蛋鸡有较好的保护力。

2019年高致病性禽流感发生率较高，死亡率低，这反而给养殖户带来的损失要大一些，原因是由于死亡率低，养殖户对高致病性禽流感重视程度不够[1]。由于时间和条件所限，本试验没有在开产前进行第4次免疫，实际在现地预防禽流感时，建议开产前免疫4次高致病性禽流感疫苗，这样对开产前和产蛋高峰期的蛋鸡都会有较好的保护力，来预防高致病性禽流感的发生。

3.2 疫苗安全性

养殖户往往对禽流感疫苗的应激反应有所顾忌，尤其是在蛋鸡开产后担心加强接种高致病性禽流感疫苗会影响蛋鸡的产蛋率[2]。本试验通过安全性试验和疫苗接种的应激反应观察，没有明显异常，说明重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗对鸡群没有应激作用，安全性高。