miR-27a和miR-378在中外猪种背最长肌中的差异表达研究

杨雪梅，顾以韧，梁 艳，陶 璇，杨跃奎，曾 凯，陈晓晖，钟志君，吕学斌（四川省畜牧科学研究院，动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066）

miRNA是一类内生的、长度约为20～22个核苷酸，其在基因表达调控、脂肪细胞分化、脂质代谢等生理过程中均发挥着重要的作用[1-3]。miR-27是迄今发现与人类脂肪细胞分化相关性最强的miRNA之一，其过表达能够降低LPL基因的表达量，进而抑制甘油三酯的积累以及脂肪生成基因的表达；miR-378与脂肪分化密切相关，其在小鼠3T3-L1前体脂肪细胞分化成熟后表达量明显上调[4-5]，miR-378还可通过影响雄烯酮和粪臭素代谢而对公猪的膻味起调控作用进而影响猪肉质[6]。鉴于这两种miRNA与猪肉品质调控存在的关系，研究于2017年采用Q-PCR技术对四川省3个地方猪种和约克夏背最长肌组织中miR-27a和miR-378的表达与肉质性状的差异进行了研究。该研究为培育优质高效的新品种/配套系提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样本采集

试验猪只均由四川省畜牧科学研究院种猪科研基地提供。每个猪种随机选取6头，共计24头，所有试验猪只于同一时间开始组建群体，30日龄断奶，采用相同营养水平和饲喂方式，达到9月龄时进行屠宰，屠宰前停食24 h，自由饮水。屠宰后迅速采集倒数3～4肋骨间对应处的背最长肌组织，用于后续的肉质相关表型指标测定和miRNA荧光定量检测。

1.2 肌内脂肪含量（IMF）测定

采用瑞士步琪（BUCHI）全自动快速抽提仪进行抽提，程序设置为萃取2 h，淋洗5 min，干燥20 min，每个样本独立测定两次。样品处理和试验操作严格按照国标GB/T 9695.1—2008《肉与肉制品游离脂肪含量测定》进行。

1.3 肌纤维直径测定

采用KD-2508型切片机（Kedee,China）制作背最长肌样本的冰冻切片，H.E染色后用显微成像系统（Optec,China）采集代表性区域图像，通过Motic Images Advanced 3.2显微图像分析软件测定每个样品的肌纤维面积。

1.4 硫胺素含量测定

样本处理和试验方法参照国家标准GB/T 5009.84—2003《食品中硫胺素（维生素B1）的测定》。

1.5 眼肌面积和瘦肉率测定

测量左胴体倒数3～4肋眼肌的宽、高，按照宽×高×0.7计算眼肌面积。按猪胴体性状测定技术规范（NY/T 825—2004）方法测定并计算瘦肉率。

1.6 miR-27a和miR-378含量的测定

引物信息见表1。所有目的miRNA定量结果均通过溶解曲线分析验证PCR产物的特异性，确保产物无引物二聚体，每个样本重复3次，每次检测含3个阴性对照。采用2-ΔΔCt法计算目的miRNA的相对表达量。

表1 引物信息

1.7 统计方法

试验数据采用Sigmaplot 12.0对性状指标和基因表达量进行ANOVA分析，相关性采用Pearson Correlation程序分析。

2 结果与分析

2.1 相关肉质指标含量

由表2可知，在4个猪种中，雅南猪肌内脂肪含量最高（5.07%），其次为内江猪（4.67%），约克夏猪最低（2.15%），雅南猪、内江猪、成华猪极显著高于约克夏猪（P＜0.01），雅南猪和内江猪显著高于成华猪（P＜0.05）。成华猪肌纤维直径最小（73.18 μm），约克夏肌纤维直径最大（92.36 μm），约克夏猪肌纤维直径极显著高于3个地方猪种（P＜0.01），3个地方猪种间差异不显著。3个地方猪种的眼肌面积在16～22 cm2之间，约克夏猪眼肌面积达 35.28 cm2，约克夏猪极显著高于3个地方猪种（P＜0.01），3个地方猪种间差异不显著。3个地方猪种的瘦肉率差异不显著，均在43%～45%之间，约克夏猪的瘦肉率最高，为62.32%，极显著高于3个地方猪种（P＜0.01）。雅南猪的硫胺素含量最高，为2.79 μg/g，其次是成华猪（1.84 μg/g），内江猪硫胺素含量最低，为 1.11 μg/g，其次为约克夏猪，为1.20 μg/g，雅南猪显著高于内江猪和约克夏猪（P＜0.05），和成华猪无显著差异，成华猪、内江猪猪和约克夏猪之间无显著差异。

表2 不同猪种相关肉质指标含量（n=6）

2.2 2种miRNA的表达水平

采用Q-PCR的方法，检测了miR-27a和miR-378在猪背最长肌中的相对表达量，其结果见表3。由表3可知，内江猪的miR-27a的相对表达量最高，其次为约克夏猪，最低的为雅南猪，内江猪的miR-27a的相对表达量显著高于其它3个猪种（P＜0.05），成华猪、雅南猪和约克夏猪之间差异不显著。内江猪miR-378相对表达量最高，其次为成华猪，最低的为雅南猪，成华猪和内江猪极显著高于雅南猪和约克夏猪（P＜0.01），成华猪显著低于内江猪（P＜0.05）。

表3 不同猪种的miR-27a、miR-378含量（n=6）

2.3 2种miRNA的表达水平与肉质相关指标含量的相关性

采用Sigmaplot 12.0分析了肉质性状相关指标和基因表达量的相关性，由表4可知，miR-27a、miR-378在背最长肌中的表达水平与肌内脂肪含量和硫胺素含量呈正相关（r肌内脂肪含量=0.6～0.71；r硫胺素=0.1～0.3）；miR-27a、miR-378 在背最长肌中的表达水平与肌纤维直径、眼肌面积、瘦肉率呈负相关（r肌纤维直径=-0.1～-0.3；r眼肌面积=-0.3～-0.4；r瘦肉率=-0.7～-0.8）。

表4 miR-27a、miR-378与肉质相关指标的相关性分析（n=6）

3 讨论

影响猪肉质风味的因素很多，其中肌内脂肪含量是重要决定因素之一，其与肉的多汁性、嫩度和风味密切相关，肌肉中的脂肪越多，则肉的多汁性越好，在4个猪种中，3个地方猪种的肌内脂肪含量在3.76%～5.07%之间，肉质优良，约克夏猪的肌内脂肪含量2.15%，极显著低于3个地方猪种；肌纤维直径越细，肉质就越细嫩，研究显示3个地方猪种的肌纤维直径在70～80 μm之间，肉质细嫩，约克夏猪肌纤维直径为92.36 μm，极显著高于3个地方猪种；胴体瘦肉率是评价胴体品质的主要指标，3个地方猪种的胴体瘦肉率在43%～45%之间，约克夏猪达62.32%，极显著高于地方猪种；硫胺素是一种非常重要的风味前体物质，其热降解是食品加工过程中风味形成的主要途径之一[7]，研究显示成华猪和雅南猪肌肉中的硫胺素含量较高。由本研究可知，地方猪种较外种猪肉质优良，风味佳、口感好，但瘦肉率较低，可作为猪种培育的育种素材。

miRNA对猪肌肉发育有着重要的调节作用[8]。本研究采用荧光定量PCR技术对成华猪、雅南猪、内江猪和约克夏猪背最长肌组织中miR-27a和miR-378差异表达进行了研究。结果显示背最长肌组织中2个miRNA的表达水平在4个猪种中趋于一致。相关性分析显示，2种miRNA在背最长肌中的表达水平与肌内脂肪含量和硫胺素含量呈正相关，与肌纤维直径、眼肌面积和瘦肉率呈负相关，表明miR-27a和miR-378对猪肉质具有正调控作用，而对猪胴体性能具有负调控作用，其可以影响猪肌肉生长和脂肪沉积，为通过调控其表达水平实现对猪肉质风味的改善提供了可能。