气相色谱内标法测定蜜饯中的甜蜜素含量

程春梅，苏建国

（1.浙江医药高等专科学校，浙江宁波315100；2.淮安市食品药品检验所，江苏淮安223300）

甜蜜素，化学名称为环己基氨基磺酸钠，甜度为蔗糖的30倍～80倍。由于其风味较自然，后苦不明显，热稳定性高，成为目前我国食品行业中应用最多的一种甜味剂。目前世界上对甜蜜素的安全性仍存在争议，因此在实际使用时需严格控制其添加量。GB2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定甜蜜素可以在一些常用食品如配制酒、饮料、果冻、冷冻饮品、腐乳、饼干、面包、糕点、熟制豆制品等中按限量使用；在蜜饯凉果中的凉果类、话化类、果糕类中的最大使用量为8.0 g/kg[1]。一些企业为了节约成本，减少食糖的使用量，超限量使用甜蜜素，近年来的监督抽查结果表明，果脯蜜饯类产品甜蜜素超限量使用问题比较严重。

目前，甜蜜素的检测方法有气相色谱法[2-5]、液相色谱法[6-7]、液相色谱-质谱法[8-9]、离子色谱法[10-11]等，国家标准GB 5009.97-2016《食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定》规定了气相色谱法外标法、液相色谱法、液相色谱-质谱法3种检测方法[12]。气相色谱法外标法是在甜蜜素的检测工作中最常用的方法。相较于外标法，内标法由于内标物质和被测组分处在同一基体中，可以消除基体带来的干扰，而且当仪器参数和温度条件发生非人为的变化时，内标物质和样品组分都会受到同样影响，这样消除了系统误差，可以提高分析的准确度和精密度。本文建立气相色谱内标法测定果脯蜜饯中甜蜜素的方法，重点研究了样品前处理条件，内标物的选择等。

1 材料与方法

1.1 仪器

VARIAN450气相色谱仪[附HP-5毛细管柱（30m×0.32 mm×0.25 μm）、氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）]：美国瓦里安；SB-800D 超声波振荡器：宁波新芝生物科技股份有限公司；Eppendorf 5804R冷冻离心机：德国艾本德；NP-30S涡旋混合器：常州恩培仪器制造有限公司；AR2140天平（感量1 mg、0.1 mg）：美国奥豪斯。

1.2 试剂

甜蜜素标准溶液[GBW（E）100173，浓度为10.00 mg/mL]：北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；乙酸乙酯、甲苯、间二甲苯、邻二甲苯（色谱纯）：天津市化学试剂研究所有限公司；硫酸、亚硝酸钠、氯化钠：国药集团化学试剂有限公司；正庚烷：黄骅市江峰化学品有限公司；以上试剂皆为分析纯；水为蒸馏水。

1.3 标准溶液系列的制备及衍生化

准确移取1.00 mg/mL甜蜜素标准溶液1.00、2.50、5.00、10.0、25.0 mL于50 mL容量瓶中，加水定容。配成标准溶液系列浓度为：0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/mL，另外加一个1.00 mg/mL甜蜜素标准溶液。

准确移取标准系列溶液20.0 mL于50 mL带盖离心管中，加入2 μL内标物。离心管置试管架上冰浴5 min后，准确加入5.00 mL正庚烷，加入2.5 mL亚硝酸钠溶液，2.5 mL硫酸溶液，盖紧离心管盖，摇匀，在冰浴中放置30 min，其间振摇3次～5次；加入2.5 g氯化钠，盖上盖后置旋涡混合器上振动1 min，4℃离心（3 000 r/min）10 min分层，取上清液放置1℃～4℃冰箱冷藏保存以备进样用。

2 结果与分析

2.1 内标物的选择

气相色谱内标法定量检测，内标物的选择是关键，通常气相色谱法内标物应该是样品中不含有且出峰时间与被测组分相接近的纯物质。本文参考相关文献[2，13-16]，考察甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、乙酸丁酯4种物质，在4支50 mL带盖离心管中各加入20 mL水，分别加入2 μL的乙酸丁酯、甲苯、邻二甲苯、间二甲苯，按照1.3的条件进行处理，参照GB 5009.97-2016《食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定》标准的条件，采用HP-5毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），柱温升温程序条件，60℃恒温6 min，进样口温度230℃，氢火焰离子化检测器（FID），温度260℃，取正庚烷层1 μL进行检测。甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、乙酸丁酯4种物质的色谱图见图1～图4。

通过研究比较所选定4种内标物的出峰时间，甲苯和乙酸丁酯出峰时间比较合适，间二甲苯的峰与甜蜜素时间较为接近，邻二甲苯出峰时间比较晚，因此本文选择乙酸丁酯作为内标物质，色谱图见图5。

图1 甲苯色谱图Fig.1 Chromatogrames of methylbenzene

图2 间二甲苯色谱图Fig.2 Chromatogrames of m-xylene

图3 邻二甲苯色谱图Fig.3 Chromatogrames of o-xylene

图4 乙酸丁酯色谱图Fig.4 Chromatogrames of butyl acetate

图5 甜蜜素标样和乙酸丁酯色谱图Fig.5 Chromatogrames of sodium cyclamate and butyl acetate

2.2 提取方法的改进

采用GB 5009.97-2016的处理方法，操作起来相对复杂，而且蜜饯样品一般在实验室操作时，采用剪刀剪碎的方式处理样品，可能存在提取转移不完全的问题，采用蜜饯样品剪刀剪碎后，精确称取打碎、混匀的样品3 g～5 g于50 mL离心管中，加水，振摇，超声提取20 min，混匀，加水至50 mL，混匀，准确移取20 mL于50 mL离心管中，加入2 μL乙酸丁酯，按1.3的条件进行衍生，然后离心，取正庚烷层用0.22 μm有机滤膜过滤后1 μL上机检测，色谱图见图6。

图6 蜜饯样品色谱图Fig.6 Chromatogrames of candied fruit sample

2.3 色谱条件的优化

图5、图6表明，采用 HP-5毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），柱温升温程序条件，60 ℃恒温6 min，进样口温度230℃，氢火焰离子化检测器（FID），温度260℃进行检测，可以达到很好的分离检测效果，但是蜜饯样品基质复杂，在60℃条件下分离基质中的一些杂质可能残留在色谱柱中对柱子造成污染，也会有部分杂质在分析下一个甚至多个样品时被冲出来，对分析造成干扰，因此采取60℃保持6 min分析后，以40℃/min升温至200℃保持3 min的方式去除杂质，60℃平衡2 min后分析下一个样品。

2.4 曲线方程、检出限

在色谱条件下，将浓度为：0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL标准样品移取20 mL于50 mL离心管中，加入2 μL乙酸丁酯，在1.3条件下衍生后依次从低浓度到高浓度进样分析，每个标准点分别进样10次，进样量1 μL，以甜蜜素的浓度为横坐标，甜蜜素与内标物的峰面积比（取十次进样平均值）为纵坐标绘制标准曲线，得线性方程为y=15.825x+0.098 5，其线性相关系数为0.999 0。

选取未检出甜蜜素的蜜饯样品，剪碎，准确称取5 g样品于50 mL离心管中，加水，加入2 μL乙酸丁酯，加入1.00 mg/mL甜蜜素标准溶液5.00 mL，按2.2的方法提取定容至50 mL。按1.3的方法进行衍生，在选定的气相色谱条件进行分析，在记录的色谱图中，根据3倍噪声所对应的浓度值计算出方法的检出限，取样量为5 g时，本方法的检出限为0.008 g/kg。

2.5 方法的精密度及加标回收率

准确称取5 g蜜饯样品，按2.2的方法处理衍生后进样分析，计算样品中甜蜜素的含量和相对标准偏差（n=10），甜蜜素含量为3.200 0 mg/kg，RSD为3.97%。按照国标方法外标法检测，甜蜜素含量为3.1940mg/kg，RSD为6.69%。

准确称取5 g蜜饯样品于50 mL离心管中，加水15 mL，加入1.00 mg/mL甜蜜素标准溶液5.00 mL，按2.2的方法提取定容至50 mL。移取提取液20 mL于50 mL离心管中，加入2 μL乙酸丁酯，按1.3的方法进行衍生，在选定的气相色谱条件进行分析，平行测定5次，结果如表1所示。按照国标方法外标法检测，被测样品加标回收率在80.64%～107.68%之间，本方法（内标法）被测样品加标回收率在88.46%～104.26%之间。

数据表明，内标法检测结果准确可靠，相对外标法精密度更高。

3 结语

1）该试验建立了气相色谱法内标法测定蜜饯中甜蜜素的方法，内标法是将一定量的纯物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测组分和内标物的质量以及其在色谱图上相应的峰面积（或峰高）比，来计算被测组分的含量，由于内标物和试样被测组分在同一分析体系内，可减小基质效应的影响；由于内标物与被测组分的峰面积的比值不受进样量波动影响，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。检测结果准确性和重复性较国标方法好。

表1 样品加标回收率Table 1 The recovery of the test

2）蜜饯基质复杂，糖类含量高，衍生后用正庚烷提取时，分层不清晰，因此采用衍生后，用正庚烷振摇提取，然后离心，取上层清液过滤后进样。

3）采用HP-5毛细管柱，程序升温：初温60℃保持6 min，以40℃/min升温至200℃保持3 min，既可以达到很好的分离效果，也能够消除基质在柱子中的残留，避免污染仪器和对下面的试样分析造成干扰。

4）通过试验得到甜蜜素的标准曲线方程为：y=15.82x+0.098，R2=0.999 0，加标回收率为88.46%～104.26%之间，方法相对标准偏差为3.97%，根据3倍噪声所对应的浓度值计算出方法的检出限，取样量为5 g时，检出限为0.008 g/kg。综上，该方法具有较高的准确度、精密度和回收率，线性关系好，适合在检测过程中推广应用。