食用明胶中微量铬含量测定的方法研究

（广西-东盟食品药品安全检验检测中心，广西南宁530021）

铬（chromium）广泛存在于自然界中，人体中微量铬对人的糖代谢、脂肪代谢、蛋白质及核酸的相互作用有着重要的影响，然而铬的过度摄入会对人体造成危害[1]，国际癌症研究机构（international agency for researchoncancer，IARC）已将六价铬列为人类致癌物[2]。食用明胶（gelatin）是用新鲜动物皮骨提取的胶原蛋白质[3]，为淡无色至淡黄色薄片状或粉粒状末，无臭、无味，应用于食品工业作赋形剂、增稠剂，是食品工业广泛应用的添加剂。人体如果摄入含铬明胶，其中的六价铬会引起细胞周期调控系统CDK6异常表达改变细胞周期和DNA相关修复过程从而引发肿瘤[4]。因此食用明胶铬含量检测已成为食品药品检测的一个重要指标。目前测定食用明胶中微量铬的前处理方式主要有微波消解、湿法消解、干法灰化[5]；测定方法主要有原子荧光（atomic fluorescence spectrometry，AFS）法、原子吸收-石墨炉（graphite furnace atomic absorption apectrometry，GF-AAS）法和电感耦合等离子质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）法[6-9]。目前国内相关标准如：GB 5009.123-2014《食品安全国家标准食品中铬的测定》[10]及GB 5009.268-2016《食品安全国家标准食品中多元素的测定》[11]中已有关于铬测定的方法，但由于食品基质的复杂性和铬元素的化学特性，按标准操作会出现某些基质的样品消解不彻底、仪器测定存在特殊干扰等情况，导致铬测定的精密度低、准确度差。本研究拟采用3种样品前处理方法及2种检测仪器进行综合全面的比较，以期确立一种快速、便捷、准确，适用于食用明胶中微量铬的测定方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

900T原子吸收光谱仪：PerkinElmer公司；Icap Q电感耦合等离子体质谱仪：Thermo公司；Mars6微波消解仪：CEM公司；P330马弗炉：Nabertherm公司；BHW-09C石墨电热消解仪：北京博通公司；ML204电子天平（感量0.1 mg和1 mg）：Mettler Toledo公司；Milli-Q超纯水仪：Millipore公司。

1.2 材料与试剂

食用明胶质控样：编号T01530；铬标准值范围：380 μg/kg～719 μg/kg，中值：600 μg/kg，分析实验室能力验证 （food analysis performance assessment scheme，FAPAS）考核组织提供。

铬标准溶液、钪标准溶液：1 000 mg/L，介质为2%硝酸，美国O2SI公司；硝酸、氢氟酸：分析纯，德国Merck公司；30%过氧化氢：优级纯，广东光华科技股份有限公司；氩气：纯度99.999%，广西国信气体研究有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液配制

1）铬标准使用液：将铬标准储备液用硝酸溶液（5+95）逐级稀释至浓度为100 ng/mL。

2）钪标准使用液：将钪标准储备液用硝酸溶液（5+95）逐级稀释至浓度为10 ng/mL。

3）标准系列溶液的配制：分别吸取铬标准使用液（100 ng/mL）0、0.5、1.00、2.00、3.00、4.00 mL 于 25 mL容量瓶中，用硝酸溶液（5+95）稀释至刻度，混匀。各容量瓶中每毫升分别含铬 0、2.00、4.00、8.00、16.0 ng。由GF-AAS和ICP-MS分别吸取标准系列溶液进行测定。

1.3.2 样品前处理方法

1.3.2.1 微波消解

准确称取试样约0.5 g（精确至0.001 g）于微波消解罐中，分别加入6 mL硝酸、4 mL硝酸和2 mL氢氟酸、4 mL硝酸和2 mL双氧水，按照微波消解的操作步骤消解试样（消解条件参见表1）。冷却后取出消解罐，在电热板上于140℃～160℃赶酸至0.5 mL～1.0 mL。消解罐放冷后，将消化液转移至10 mL容量瓶中，用少量水洗涤消解罐2次～3次，合并洗涤液，用水定容至刻度。同时做试剂空白试验、加标回收试验和平行性试验，微波消解程序见表1。

表1 微波消解仪工作条件Table 1 Working parameters of microwave digestion

1.3.2.2 湿法消解

准确称取试样约0.5 g（精确至0.001 g）于消化管中，分别加入6 mL硝酸、4 mL硝酸和2 mL氢氟酸、4 mL硝酸和2 mL双氧水，在可调式电热炉上消解（升温程序：120℃保持0.5 h、升温至180℃2 h、升温至200℃）。若消化液呈棕褐色，再加硝酸，消解至冒白烟，消化液呈无色透明或略带黄色，取出消化管，冷却后用水定容至10 mL。同时做试剂空白试验、加标回收试验和平行性试验。

1.3.2.3 干法灰化

准确称取试样约2 g（精确至0.001 g）于30 mL坩埚中，置于马弗炉中，于550℃恒温3 h～4 h，至试样呈白灰状，取出冷却，用硝酸溶液（1+1）溶解并用水定容至10 mL。同时做试剂空白试验、加标回收试验和平行性试验。

1.3.3 测定方法

1.3.3.1 原子吸收-石墨炉法（GF-AAS）

铬元素原子化温度高，经对比，食用明胶的测定即使不加基体改进剂，原子化过程中也不会出现干扰，因此选择不使用基体改进剂以获得更高的灵敏度。测定波长：357.87 nm；狭缝宽度：0.7 nm；灯电流：5 mA；进样体积：20 μL；背景扣除：塞曼扣背景；GFAAS工作参数见表2。

表2 GF-AAS主要工作参数Table 2 Main operating parameters of GF-AAS

1.3.3.2 电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）

铬同位素有50Cr、52Cr、53Cr、54Cr，其中52Cr天然丰度最高且干扰较低，选为待测同位素。52Cr主要的多原子离子干扰为40Ar12C+、36S16O+、38Ar14N+、36Ar16O+，使用动能歧视型碰撞池（kinetic energy discrimination，KED）模式，通入氦气作为碰撞气，能有效减少干扰。ICP-MS测量过程中，被测元素的信号受样品溶液中共存元素或基体元素的影响，引起被测物信号的增强或减弱的现象，称之为抑制或增敏效应[12]。抑制或增强效应可通过内标法进行校正，使用10 ng/mL的钪（Sc）作为内标元素可以减少这些干扰及仪器各种条件的波动带来的影响，ICP-MS工作参数见表3。

1.3.3.3 铬含量计算公式

表3 KED模式ICP-MS主要工作参数Table 3 Main operating parameters of ICP-MS in KED mode

式中：X为样品中铬的含量，μg/kg；Cx为样品溶液中铬的质量浓度，ng/mL；C0为空白溶液中铬的质量浓度，ng/mL；V为样品溶液定容体积，mL；m为样品称样量，g。

2 结果与分析

2.1 不确定度分量来源的分析

GF-AAS法及ICP-MS法测定明胶铬含量的不确定度的主要来自：标准曲线拟合计算浓度过程；样品重复性测定次数；样品的处理过程；标准溶液的配制过程[13]；分析仪器的相对不确定度。

2.2 样品测定结果分析

本文比较了3种不同的消解方式，结果见表4和表5。

表4 GF-AAS测定铬结果Table 4 GF-AAS results of chromium

由表4和表5可知，干法灰化法在样品经马弗炉灰化后加酸溶解并转移的过程中，易造成铬元素损失；湿法消解耗时长且消解不够彻底；微波消解耗时短且消解效果好，平行样精密度高。研究了不同的酸体系的消解效果，结果表明，硝酸-过氧化氢体系消解效果最佳，过氧化氢能够使样品消解液更澄清透亮，起到氧化脱色作用，羟自由基同时也更利于有机物的分解，从结果来看该消解体系得到的样品溶液测定结果精密度最高，也接近质控样的标准值；而硝酸-氢氟酸体系消解过程中引入氟离子，在赶酸过程中即使加入高氯酸也较难将氟赶尽，在高氯酸赶F的操作中，时间不易控制，时间不够或过长均会导致铬测定结果的偏高或偏低[14]，效果不理想。此外，还比较了不同的仪器，对同一消解方式的测定结果：铬是高温元素，在原子化温度（横向加热）高达2 300℃时，干扰极少，原子吸收-石墨炉测定的结果比较稳定，而电感耦合等离子体质谱测定铬时，铬易被同质荷比的多原子离子干扰，开启碰撞模式消除这类干扰则使灵敏度下降，导致测定结果稳定性较原子吸收-石墨炉法差。

表5 ICP-MS测定铬结果Table 5 ICP-MS results of chromium

2.3 标准曲线测定结果

铬标准曲线测定结果见图1，图2。

图1 GF-AAS标准曲线图Fig.1 GF-AAS calibration curve

2.4 检出限

GF-AAS和ICP-MS的仪器检出限均采用纯水连续11次测定铬信号值的3倍标准偏差所相当的铬浓度，再经过稀释倍数和取样质量及单位转换系数的换算，得到对应方法检出限GF-AAS法：0.01 mg/kg；ICPMS法：0.006 mg/kg，均能很好地满足试验灵敏度需求。

图2 ICP-MS标准曲线图Fig.2 ICP-MS calibration curve

2.5 回收率试验

按照不同前处理方法分别称取试样，向其中加入与称取试样铬含量接近的铬标准溶液，分别按照相应的前处理方法制备得到回收率试样待测液，供GFAAS及ICP-MS测定，得到不同前处理条件下的试样回收率，回收率见表6、表7。

表6 GF-AAS加标回收率Table 6 GF-AAS spike recovery

表7 ICP-MS加标回收率Table 7 ICP-MS spike recovery

综合比较表6、表7中回收率情况，可以看出干法回收率略低，各种酸体系的微波消解和湿法消解所得回收率测定液，在GF-AAS和ICP-MS中测得回收率结果均比较满意。

2.6 精密度试验

按照2.2中微波消解（体系1～体系3）、湿法消解（体系1～体系3）、干法灰化的7种前处理方式，各取7份平行样进行前处理，所得7组待测样品溶液分别在GF-AAS和ICP-MS上进行精密度测定，结果表明相比较于其他前处理方法，硝酸-过氧化氢体系—微波消解这一前处理方法所得的结果精密度最好，在GFAAS上测得RSD=1.7%，在ICP-MS上测得RSD=2.6%，试验数据详见表8、表9。

表8 GF-AAS精密度（n=7）Table 8 GF-AAS precision（n=7）

表9 ICP-MS精密度（n=7）Table 9 ICP-MS precision（n=7）

2.7 重现性

取同一食用明胶质控样，在不同的实验室设备条件下，由不同的人员按照同样的方法操作（试验2），得到的铬测定结果与原测定结果（试验1）对比见表10、表11。

表10 GF-AAS测定铬结果Table 10 GF-AAS results of chromium

表11 ICP-MS测定铬结果Table 11 ICP-MS results of chromium

3 结论与讨论

硝酸-过氧化氢体系-微波消解-原子吸收-石墨炉这一测定方法，样品消解效果最好，平行样测定结果精密度最高，所得结果较接近标准物质铬含量的标准值，加标回收测定结果最为满意。如不加过氧化氢溶液，从湿法消解结果及ICP-MS测定结果看来，精密度、偏离标准值、加标回收率等方面结果较差。

本研究经过多方面对比，样品使用硝酸-双氧水消解体系进行微波密闭消解并采用原子吸收-石墨炉法测定食用明胶中微量铬，灵敏度高、精密度高、准确度好、重现性好、回收率高，质控样测定结果接近其中值，是适合用于明胶中微量铬测定的较好的方法。