肝癌靶向多肽载体的研究进展*

刘 祺，李松涛 ，赵桂琴

（承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000）

我国为肝癌高发地区，近年来，肝癌的发病率和致死率呈持续上升趋势，成为病死率位居第二位的恶性肿瘤，严重威胁国人的生命健康[1]。肝癌血供丰富，具有生长快、易转移的特点，使得肝癌的治疗更为困难[2]。常规化疗药物对肝癌细胞没有选择性，在杀伤癌细胞的同时，也会杀伤正常组织细胞，具有比较严重的毒副作用[3]。肿瘤靶向药物递送系统是一类能够使药物选择性地作用于肿瘤细胞的新型给药系统[4]，对正常组织细胞没有影响，因此，能够降低药物的毒副作用。肿瘤靶向药物递送系统中的给药载体包括单克隆抗体、多肽、脂质体和纳米粒等，其中的多肽因具有高亲和性、较好的特异性和安全性的特点而受到广泛关注，目前已成为一种发展迅速且应用日益广泛的新型肿瘤靶向给药载体[5]。本文对近年来国内外关于肝癌靶向多肽载体取得的研究进展进行综述，以期为靶向抗肿瘤药物的研发提供依据。

1 肝癌靶向多肽载体概述

肿瘤分子生物学研究表明，肝癌细胞表面的一些特异性蛋白标志物往往呈过表达状态，如转铁蛋白受体[6]和“叉头框”蛋白FoxM1[7]等，而它们在正常组织细胞表达量很少或不表达，使得这些蛋白标志物作为药物的作用靶点成为可能。以对肝癌细胞表面过表达的特异性蛋白分子具有高亲和性的多肽作为靶向给药载体，将其偶联的抗肿瘤药物选择性地富集在肝癌细胞而不杀伤正常细胞，可实现肝癌的靶向药物治疗[8]。研究靶向肝癌的多肽偶联药物递送系统，首先要发现具有肝癌细胞靶向结合活性的多肽载体，可以通过噬菌体展示肽库[9]、化学合成肽库和虚拟筛选等渠道获取靶向多肽载体。国内外学者在肝癌靶向多肽载体的发现及其在构建靶向抗肿瘤药物的应用方面已经取得了很多积极的研究成果。

2 肝癌靶向多肽载体

2.1 A54肽

2.1.1 含A54肽的肝癌靶向载药胶团：A54肽（肽序列：AGKGTPSLETTP）是经过体内噬菌体展示技术筛选得到的一种肝癌组织特异性黏附多肽[10]。Du等[11]通过A54肽修饰聚乙二醇化的壳聚糖硬脂酸嫁接物胶团（A54-PEG-CS-SA），与正常肝细胞相比，BEL-7402肝癌细胞对该胶团的摄取率显著增加；包裹抗肿瘤药物阿霉素（DOX）后制备得到的嫁接物载药胶团（A54-PEG-CS-SA/DOX）的体内外抗肿瘤活性均高于阿霉素，而毒性较阿霉素有所降低，表明经A54肽修饰后的载药制剂的疗效和靶向性均得到明显改善。Liu等[12]利用A54多肽修饰聚乙二醇化的糖脂纳米载体，包裹抗肿瘤药物阿霉素后制备得到嫁接物载药胶团（A54-PEG-CSO-ss-SA/DOX）。该嫁接物载药胶团的分子内二硫键（-ss-）在浓度为10mM的还原性谷胱甘肽溶液（体外模拟的肿瘤细胞内高浓度还原性谷胱甘肽微环境）中可以快速发生断裂，使嫁接物载药胶团分解，从而高效释放出阿霉素；此外，该嫁接物载药胶团在BEL-7402荷瘤小鼠体内主要分布在肝癌组织，且药物释放只发生在肿瘤组织。因此，A54-PEG-CSO-ss-SA/DOX嫁接物载药胶团具有肿瘤组织靶向定位与还原响应性药物释放的双重特点，在保持阿霉素抗肿瘤药效的同时，也减轻了其对正常组织的毒性。

2.1.2 含A54肽的肝癌靶向多肽偶联药物：孟娇等[13]将A54肽和其序列突变对照肽分别与阿霉素偶联，并作用于BEL-7402肝癌细胞株，通过细胞增殖抑制活性实验发现，经A54肽-阿霉素偶联物处理后的肝癌细胞增殖活性明显降低，而突变肽-阿霉素偶联物对肝癌细胞的影响很小，表明A54肽-阿霉素偶联物在体外对肝癌细胞有一定的靶向杀伤作用。岳苗苗[14]以可被肝癌细胞内组织蛋白酶（Cathepsin B）特异性降解的肽段GFLG为连接臂，采用化学合成的方法将A54肽与阿霉素进行偶联，构建肝癌靶向多肽偶联药物A54-GFLG-DOX。药物体外结合活性实验结果显示，A54-GFLG-DOX与BEL-7402肝癌细胞共孵育24h后，明显聚集在细胞核部位，对肝癌细胞具有靶向性；体外细胞毒实验确定了A54-GFLGDOX对BEL-7402和SMMC-7721肝癌细胞有明显的杀伤活性；以BEL-7402肝癌荷瘤裸鼠为动物模型的体内抗癌活性实验结果表明，A54-GFLG-DOX在肿瘤部位的富集较正常组织更为明显，不但保留了阿霉素的抗肿瘤活性，且毒副作用较阿霉素明显降低[14]。

2.2 SP94肽

2.2.1 SP94肽在构建肝癌诊断试中剂的应用：SP94肽（肽序列：SFSIIHTPILPL）是从氨基酸肽库中筛选得到的一种新型肝癌靶向多肽载体[15]。Li等[16]以tricine-EDDA为协同配体，利用99mTc标记HYNIC-SP94制备成像探针99mTc tricine-EDDA/HYNIC-SP94，将不同比活度的99mTc-tricine-EDDA/HYNIC-SP94与人Huh-7肝癌细胞体外共孵育，结果显示该探针与Huh-7细胞的特异性结合率随着标记产物浓度的增加而升高，后呈现饱和状态。另外，该课题组用未标记99mTc的HYNIC-SP94预先作用，阻断SP94肽的特异性作用靶点，然后再用标记物99mTc-tricine-EDDA/HYNIC-SP94作用于Huh-7荷瘤裸鼠，其在荷瘤裸鼠体内的摄取率明显降低[17]，表明该标记物对Huh-7细胞的体内结合活性是通过SP94肽与其作用靶点的靶向结合而介导的。以上结果验证了以99mTc标记的SP94肽可以用于诊断肝癌。

2.2.2 SP94肽在构建肝癌靶向给药系统中的应用：张红绪等[18]将蜂毒素与SP94肽结合，通过序列的改造优化，在大肠杆菌中表达出具有靶向特性的融合蛋白，该融合蛋白可竞争性地抑制与肝癌细胞具有高度亲和力的噬菌体克隆PC94结合到肝癌细胞膜上，为肝癌的靶向治疗提供了新的思路。Wu等[19]利用近红外荧光成像技术，研究了结合SP94肽的聚乙二醇化脂质体阿霉素（SP94-conjugated PEGylated liposomal doxorubicin， SP94-LD）在肝癌荷瘤裸鼠体内的药物分布及抗肿瘤作用，结果显示SP94-LD可显著增加肿瘤组织内的药物蓄积，与未结合SP94肽的非靶向LD相比，SP94-LD对SK-HEP-1肝癌荷瘤裸鼠的抗癌效果显著提高，提示SP94-LD具有进一步开发成为靶向抗肝癌药物的潜在应用前景。

2.3 P201肽 P201肽是通过噬菌体展示技术筛选得到的一种对FoxM1具有高亲和力的十二肽[20]。FoxM1属于“叉头框”（fork head box，Fox）蛋白家族中的重要成员，是一种典型的与增殖相关的转录因子[21]。研究证明，FoxM1在肝癌细胞中过表达，被认为是肝癌靶向药物治疗的重要靶点[22]。邬怡然等[20]将P201肽与HepG2人肝癌细胞上的FoxM1靶向结合，采用AO-EB双染法观察发现，肝癌细胞有凋亡的特征，且随着作用时间的延长，凋亡细胞数逐渐增多，表明P201肽能够抑制肝癌细胞的活力、诱导其凋亡。刘文荣等[23]通过肽库筛选了一条多肽9R-P201，以HepG2人肝癌细胞为模型，发现9R-P201肽能在细胞核内聚集并使肝癌细胞FoxM1的表达明显下降。该课题组进一步利用平板克隆形成、细胞划痕及Transwell迁移实验观察发现，9R-P201能抑制HepG2细胞的增殖与迁移，AO-EB双染法发现9R-P201肽可诱导HepG2细胞凋亡[24]。

2.4 肝癌细胞转铁蛋白受体靶向多肽载体 T7肽（肽序列：HAIYPRH）和BP9肽（肽序列：AHLHNRS）均是通过噬菌体展示技术筛选得到的7肽，二者对肝癌细胞表面过表达的转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）具有高亲和性[25-26]。严秀云等[27]构建了一种具有潜在肝癌靶向作用的T7肽修饰的氧化还原敏感聚酰胺-胺（T7-PSSP）复合物，并将其作为siRNA递送载体，经过细胞摄取实验发现，该复合物能显著增加人肝癌细胞HepG2对siRNA的摄取；通过电泳实验发现，T7-PSSP复合物能稳定、快速地运载siRNA，并将其有效释放至肝癌细胞，实现靶向治疗。Zheng等[28]将具有抗肿瘤活性的麻风树毒蛋白（curcin）与BP9肽的融合基因克隆到pQE-30质粒中，构建一种pQE-30-curcin-BP9重组载体，然后该重组载体被转移到大肠杆菌M15中，经诱导剂异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导、表达和纯化等步骤，得到了一种融合蛋白（curcin-TfRBP9），该融合蛋白对TfR过表达的人HepG2肝癌细胞具有显著的细胞毒性，而对正常肝细胞没有影响，说明BP9肽可以作为TfR过表达肝癌细胞的靶向给药载体。

2.5 其它肝癌靶向多肽载体 除了上述几种应用较多的肝癌靶向多肽，还有其它一些肝癌靶向多肽。X1肽（肽序列：QSFASLTDPRVL）是通过噬菌体随机十二库筛选得到的能特异性地结合肝癌细胞的靶肽，但与正常肝细胞无明显结合[29]。张旭等[30]以肝癌细胞为靶细胞，对噬菌体七肽库进行随机筛选得到HBP3肽，为进一步研制靶向治疗肝癌的药物奠定了基础。Lee等[31]通过蛋白质组质谱法鉴定出一种L5肽（肽序列：RLNVGGTYFLTTRQ），并发现其对肝癌细胞表面过表达的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC-3）具有高亲和力，有望成为诊断或治疗GPC-3过表达肝癌细胞的靶向多肽载体。

3 结语与展望

近年来，靶向治疗在肝癌的临床治疗中越来越受到重视。以多肽为靶向载体的药物递送系统在提高药物的选择性、降低药物毒副作用等方面取得了较大进展，但由于多肽类化合物稳定性差、在生物体内易酶解等缺点[32]，使得靶肽药物递送系统的发展受到了一定限制。未来，如何提高多肽类靶向载体的稳定性是肝癌靶向多肽药物递送系统研究领域需要重点关注并解决的关键问题。