神经干细胞的自我更新与衰老

孙月彤，李洪艳，邹伟

辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室，辽宁 大连116081

干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，在一定条件下可以分化成多种功能细胞。神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是神经系统中恒定存在的可进行自我更新及多向分化的原始细胞，可以分化为神经元和多种胶质细胞。近年来，越来越多的研究关注于NSCs 且取得了许多新的进展，而对NSCs 移植治疗神经系统疾病和损伤的研究也愈发深入。然而，NSCs 的增殖与分化能力会逐渐衰退，这成为制约NSCs 体外扩增的问题之一。从分裂新生到衰老死亡是细胞的必经历程，NSCs 也无法避免，这也成为NSCs 临床应用的瓶颈。本文简要综述了NSCs 自我更新与衰老机制的基础，旨在为NSCs 临床应用及干细胞组织工程研究提供理论依据。

1 NSCs 的发现及其在脑组织内的分布

Reynolds 和Richards 于1992 年首 次 从成年 鼠的纹状体和海马中分离出一种可以自我更新并具有多向分化潜能的细胞群落，命名为NSCs[1]。目前认为NSCs 主要存在于哺乳动物的中枢神经系统，尤其胚胎时期，NSCs 存在于大部分脑区，如皮质、嗅球、纹状体、海马、脊髓等[2-3]。也有研究表明，人类胚胎的室管膜下区、海马、嗅球均有NSCs 存在，近年发现成人海马、嗅球、室管膜下区等脑区域内都存内源性NSCs 或前体细胞[4]。

2 NSCs 的自我更新

干细胞的特征是具有极强的自我更新能力并可分化为多种类细胞。干细胞能够通过2 种分裂方式来维持自我更新，即对称分裂和不对称分裂[5]，NSCs 作为干细胞的一个重要分类也具有这2 种分裂方式。1 个NSCs 分裂为2 个NSCs 或2 个神经祖细胞（neural progenitor cells，NPCs）为对称分 裂，1 个NSCs分裂为1 个NSCs 和1 个NPCs 或1个NSCs 和1 个凋亡细胞为不对称分裂[6-7]。值得注意的是，在神经系统发育过程中，NSCs 先通过对称分裂进行扩增，再经历不对称的神经源性分裂，即其中一个子细胞仍然是一个增殖性的NPCs，而另一个子细胞经过一个或多个轮回扩增分裂后最终分化，一旦NSCs 完成了不对称的神经源性分裂，它们通常会经历细胞凋亡或进入衰老状态并减少增殖[8]。

大量研究发现，Wnt/β-catenin 和Notch 信 号通路在控制干细胞增殖和分化中起关键作用。Chen 等[9]曾报道，缺氧缺血后氧化亚硝酸盐生成并增加了β-catenin 的核内积累，同时激活NSCs的Wnt/β-catenin 信号通路，发挥其促进神经发生的作用。而脑源性神经营养因子（BDNF）的过表达则会增强Wnt/β-catenin 信号通路促进体外hESC-NSC 的生长[10]。此外还发现[11]，NSCs 的Wnt/β-catenin 信号通路在3%的低氧培养条件下被进一步激活并缩短了细胞周期，从而促进了NSCs 的增殖。这说明神经系统处于不利条件时，能够提升NSCs 的干 性，增 强Wnt/β-catenin 信号通路的表达，促进NSCs 的增殖及分化，并抵抗神经损伤进行自我修复。在基因水平上，microRNA 也参与了Wnt/β-catenin 通路的调节。研究表明，miR-124可以抑制β连环蛋白抑制基因1（dishevelled binding antagonist of beta catenin 1，DACT1）的表达并刺激Wnt/β-catenin 信号通路，从而促进NSCs的增殖及分化[12]。但与miR-124 的正向促进作用不同，miR-148b 能够抑制Wnt/β-catenin 通路的表达。脑损伤后的miR-148b 过表达会抑制Wnt/βcatenin 通路的传导和周期蛋白D1 的表达，减弱神经干细胞的增殖和分化[13]，而Notch 信号通路的激活或抑制也被证明决定了神经干细胞的增殖和分化[14]。研究表明，NSCs 中miR-124 的过度表达可抑制Notch 配体DLL4 的表达而使Notch 信号通路失活，并以此促进NSCs 增殖及神经分化[15]。但出现脑损伤后，某些治疗药物对NSCs 的促增殖作用是通过上调Notch 信号通路，促进CDK4、周期蛋白D1、NICD、Hes1 的表达，而这种激活作用受自我更新相关基因Notch1 和HES1 的调节[16-17]。

3 NSCs 的自噬和凋亡

自噬是真核生物中普遍存在的一种细胞自我保护机制，是指吞噬自身内容蛋白或细胞器后包入囊泡并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，从而降解所包裹的内容物的过程[18]。正常机体内的大多数干细胞处于静息状态且寿命很长。静息状态下，干细胞清除废物和衰老细胞器的能力有限，且为了完成分化需要对自身进行重塑，因此比其他类型的细胞更需要自噬的调节[19]。虽然自噬在维持NSCs 稳态方面起重要作用，但过度自噬会导致细胞的自我消除。K+通道是一类广泛分布于细胞膜上且亚型众多的离子通道，不同类型的K+通道可以通过激活Akt/mTOR 或AMPK/mTOR通路诱导内皮细胞、心肌细胞、肝细胞等多种细胞的自噬[20]。Chung 等用GFP-LC3 表达质粒对NSCs 进行转染，发现自噬蛋白LC3-II、Beclin-1 表达水平上调能够促进NSCs 的过度自噬[21]。虽然过度自噬会导致NSCs 的自我消除，但令人惊奇的是，在进行神经分化时，自噬能够促进NSCs 向神经元分化。Pablo 等[22]发现，在NSCs 向神经元分化的过程中，神经源性标记物Ngn1（神经源蛋白1）、NeuroD（神经源性分化蛋白）、β-III-tubulin（微管蛋白）明显上调，同时自噬相关基因Atg7、Becn1、Ambra1 和LC3 同步上调，该结果证明了自噬参与NSCs 向神经元分化的过程。自噬对NSCs而言是一把双刃剑，倘若能够人为地对自噬进行调节，就可以有效调控NSCs 的分化和衰老进程。

细胞凋亡也对NSCs 的功能有着重要影响。许多研究表明，细胞凋亡蛋白酶（caspase）在细胞凋亡进程中起重要作用。Yuan 等发现，棕榈酸通过上调Bax 和caspase-3 和下调Bcl-2 的表达来促进NSCs 的凋亡，其机制与JNK 信号转导有关[23]。Zou 等[24]观察到异丙酚能够通过内源性和外源性2 种途径诱导小鼠胚胎NSCs 的凋亡，且2 种凋亡途径间存在相互作用，即由外源性途径激活的caspase-8 裂解产生tBid（细胞凋亡调控蛋白），tBid 由胞浆转移到线粒体膜上刺激细胞色素C 的释放，并与胞浆蛋白APAF-1 激活caspase-9，加强外源性途径的凋亡效应。由此可见，多种caspase的激活及凋亡相关蛋白的释放可加速细胞凋亡。Wan 等[25]发 现，NSCs 经p38-shRNA转染并经TNFα处理后会增加Bax 和caspase-3 等促凋亡分子的分泌，降低抗凋亡分子Bcl-2 的表达，从而加速NSCs 的凋亡，但是通过靶向抑制p38-MAPK 通路则可逆转TNF-α 诱导的细胞凋亡。这表明TNFα与MAPK 在NSCs 中的相互作用。以上结果也说明，与正常细胞相比，NSC 中的caspase 可与p38- MAPK 或JNK 信号转导通路共同调控细胞凋亡。

4 NSCs 的衰老

虽然NSCs 具有多项分化潜能和极强的自我更新能力，但同机体的衰老一样，NSCs 也会逐渐衰老并丧失干性，而其细胞活力和增殖能力取决于端粒酶活性及端粒的损耗程度。Ferrón 等[26]从缺乏端粒酶RNA 成分的小鼠体内分离成体及胚胎NSCs 进行体外增殖，发现在缺少端粒酶活性的情况下，端粒受到侵蚀且p53 蛋白表达水平增加，最终导致成体NSCs 丧失增殖能力；而胚胎NSCs在端粒缩短和核p53 蛋白表达水平增加的情况下仍能进行广泛增殖。除了端粒及端粒酶的影响，NSCs 活性还受DNA 甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等多种表观遗传变异因素的调控。在衰老过程中，染色质组织会发生显著变化，从而改变转录水平。有研究表明，间充质干细胞（mesenchyma stem cell，MSCs）中甲基化CpG 结合蛋白2（MECP2）的部分沉默能够诱导MSCs 的衰老，同时导致受损DNA 的增加[27]。最近，Melone 等[28]还发现，MECP2 基因缺失会导致小鼠体内衰老的NSCs 数量增加、增殖能力降低且未修复的DNA病灶积累，最终加速神经系统的衰老。上述研究表明，NSCs 的衰老受基因、蛋白修饰、端粒长度及活性等诸多因素的影响。因此，解决NSCs 的衰老问题不仅要从蛋白水平进行调控，还需要寻找与衰老相关的基因靶点，实现蛋白和基因水平的双项调控。

与活化的NSCs 一样，未经活化的静息NSCs也同样面临衰老的问题。机体内贮存干细胞的特化结构通常称为干细胞池（stem cell pool），这些干细胞池内不仅包含活化的干细胞，还包含静息干细胞。它们的种类各异，作用相似。然而到目前为止，维持增殖和衰老的机制尚不清楚。例如，如何维持蛋白质稳态和处理蛋白质聚集在很大程度上是未知的。Brunet 等[29]的最新研究指出，静息与活化状态的NSCs 在蛋白质稳态网络上存在不同，活化的NSCs 拥有活性蛋白酶体，而静息的NSCs 含有大的溶酶体，溶酶体内储存着不断积累的蛋白质聚集体，同时静息NSCs 中溶酶体活性的波动会影响蛋白质聚集体积累和静息NSCs激活的能力。当NSCs 处于衰老状态时，静息的NSCs 在其溶酶体活性上显示出缺陷，且蛋白质聚集体的积累增加，导致活化能力降低。这也提示可以通过激活衰老NSCs 中的溶酶体或者让NSCs处于饥饿状态来限制其蛋白合成，从而清除干细胞池内的蛋白聚合物，恢复衰老NSCs 的活化能力，使静息NSCs 重新呈现年轻态。

5 结语

神经退行性疾病主要由大脑或脊髓中的神经元和胶质细胞受损引起。与传统的康复治疗和长期药物维持治疗相比，近年来，日趋成熟的干细胞移植治疗法为神经退行性疾病患者带来新的希望。由于NSCs 能够分化为神经元及各种胶质细胞，使其成为干细胞治疗的重要细胞来源之一。一项最新研究指出，星形胶质细胞的功能障碍是神经发育和神经退行性疾病发病机制的驱动因素，而星形胶质细胞是由NSCs 后期分化产生[30]。因此，NSCs 在治疗神经退行性疾病方面存在巨大潜力。相信通过对NSCs 的衰老及自噬的不断研究，定会解决体外培养NSCs 的早衰及功能减退等问题，最终实现从根本上治疗神经退行性疾病。