毕赤酵母表达环状芽胞杆菌壳聚糖酶及其水解产物组成与结构分析

程 功，焦思明，贾培媛，任立世，冯 翠，张毓宸，李建军，杜昱光

(中国科学院 过程工程研究所 生化工程国家重点实验室，北京 100190)

壳寡糖是甲壳素或者其脱乙酰产物壳聚糖经物理、化学或酶学等方法降解产生的寡聚物，由氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成，通常聚合度小于20[1]。研究显示，壳寡糖具有抗炎、抗肿瘤及激活植物免疫等一系列生物活性[2-5]。在工业上，壳寡糖主要通过以下方式获得：虾蟹壳经酸法脱钙及碱法脱蛋白后得到甲壳素，经高浓度强碱脱乙酰得壳聚糖，再经酶法水解等方式最终获得壳寡糖[6]。现有制备工艺生产的壳寡糖的脱乙酰度通常高于85%，组分种类较少，主要为聚合度小于10的全脱乙酰壳寡糖。

壳寡糖生物活性的发挥与其结构，如聚合度及脱乙酰度甚至乙酰基在寡糖链上的分布等密切相关[7]。然而，现有壳寡糖的工业制备过程中已经脱去大部分的乙酰基，且通常使用非特异性商品酶类，如纤维素酶[8]、蛋白酶[9]及脂肪酶[10]等对壳聚糖进行水解，难以实现产物壳寡糖结构的有效调控。为解决上述难题，拟对工艺进行如下改进：制备脱乙酰度小于80%的壳聚糖，筛选并高效表达壳聚糖水解酶类，利用这些酶类水解低脱乙酰度底物，获得特定结构壳寡糖。

壳聚糖酶(chitosanase，EC 3.2.1.132)可通过内切方式对壳聚糖底物进行水解，产物即为壳寡糖。根据壳聚糖酶对壳聚糖底物水解位点识别的差异，可将其大致分为3种类型：Ⅰ型壳聚糖酶可同时识别并水解GlcN-GlcN及GlcNAc-GlcN糖苷键，Ⅱ型壳聚糖酶仅识别并水解GlcN-GlcN糖苷键，Ⅲ型壳聚糖酶可同时识别并水解GlcN-GlcN及GlcN-GlcNAc糖苷键[11]。利用这些不同水解类型的壳聚糖酶，可以制备不同结构特征的壳寡糖。Chen等[12]已经在毕赤酵母中高效表达了来源于烟曲霉的壳聚糖酶，该酶属于Ⅰ型壳聚糖酶[13]。Saito等[14]已证实来源于环状芽胞杆菌的壳聚糖酶属于Ⅲ型壳聚糖酶。目前，尚无该酶在毕赤酵母中表达的研究报道。与其他表达系统相比，毕赤酵母表达系统结合高密度发酵可实现蛋白高效分泌表达，已在工业及食品用酶制剂领域取得较广泛应用。

因此，本研究中，笔者选择利用该表达系统对来源于环状芽胞杆菌的壳聚糖酶进行表达，利用产物酶水解制备低脱乙酰度壳寡糖并对其组成及结构特征进行分析，为特定结构类型壳寡糖的功能研究及应用提供必要前提。

1 材料与方法

1.1 材料

甲壳素，Sigma-Aldrich公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、T4连接酶及E.coliDH5α化学感受态细胞，宝日医(北京)生物技术有限公司；毕赤酵母表达载体pPIC9，优宝生物，pGBG1为pPIC9信号肽核酸序列根据毕赤酵母密码子的偏好性优化后的载体[15]；毕赤酵母GS115、XhoⅠ、NotⅠ、BglⅡ及色谱纯乙腈，美国Thermo Fisher公司；蛋白Marker，上海天能科技有限公司。其他试剂均为市售分析纯。毕赤酵母培养基MD、BMGY和BMMY的配制方法及电转化感受态细胞制备方法均参考毕赤酵母表达手册，美国Thermo Fisher公司。

1.2 仪器

ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)、Waters XEVO G2-S QTOF型质谱仪(配有Lock-spray 接口、电喷雾离子源(ESI)及Masslynx 4.1质谱工作站软件)，美国Waters公司；AVANCE Ⅲ 600 MHz型核磁共振仪，Bruker公司；DYY-6C型核酸及蛋白电泳系统，北京六一生物科技有限公司；Tanon-1600型凝胶成像系统，上海天能科技有限公司；MicroPulserTM电转仪，美国Bio-Rad公司；LGJ-10FD型真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；RE-2000B型旋转蒸发器，巩义市英峪高科仪器厂；L535R型低温冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 环状芽胞杆菌壳聚糖酶基因序列优化、全合成及表达载体构建

使用毕赤酵母偏好的密码子，对环状芽胞杆菌菌株MH-K1[14]的壳聚糖酶(GenBank登录号:BAA01474，43-301)编码基因序列进行优化，在5′及3′末端分别添加XhoⅠ及NotⅠ酶切位点序列。委托北京擎科新业生物技术有限公司将设计好的基因序列进行全合成。利用内切酶XhoⅠ及NotⅠ回收载体pUC18上的目的基因片段，使用T4连接酶连接至相同内切酶水解的表达载体pGBG1中，转化至E.coliDH5α化学感受态细胞中。使用酶切及双末端测序方法对构建表达载体的正确性进行验证。

1.3.2 环状芽胞杆菌壳聚糖酶毕赤酵母表达

使用BglⅡ对重组质粒进行线性化并切胶回收目的基因，电转至毕赤酵母GS115中。使用MD平板筛选获得重组子，转接至含有胶体壳聚糖(质量分数0.5%)的BMMY琼脂平板上，在30 ℃条件下培养2～3 d，筛选出水解圈最大的菌落。将菌落接种于200 mL BMGY培养基中，在28 ℃、250 r/min条件下培养48 h，离心弃上清，加入200 mL的BMMY诱导表达。后续每隔24 h补加1次甲醇至其终体积分数为1%，共计诱导120 h后离心收集上清液。使用SDS-PAGE法检测上清液中的蛋白表达情况，Bradford法测定上清的蛋白浓度。

1.3.3 低脱乙酰度壳寡糖制备及组成分析

使用表达的壳聚糖酶水解脱乙酰度为62%的壳聚糖[15]制备壳寡糖，具体方法如下：称取50 g壳聚糖，加至1 000 mL水中，加入乙酸溶解并调节至pH 6.0；再加入10 mL壳聚糖酶，在40 ℃条件下搅拌反应48 h；离心去除不溶物，使用旋转蒸发仪将上清浓缩至约300 mL后冻干。称取10 mg壳寡糖冻干样品，使用超纯水配制成1 mg/mL溶液。

液相检测条件：使用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱，流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～2 min，15% A；2～32 min，15%～50% A；32～33 min，50%～80% A；33～36 min，80% A；36～37 min，80%～15% A；37～44 min，15% A)，柱温为35 ℃，流速为0.3 mL/min，进样量为1 μL。

质谱检测条件：ESI源，正离子扫描模式，毛细管电压为3 kV，锥孔电压为60 V，离子源温度为150 ℃，脱溶剂气温度为500 ℃，锥孔气流量为50 L/h，脱溶剂气流量为800 L/h，碰撞能量为30～60 V，离子能量为3 V，每0.25 s采集1次图谱；质量扫描范围为150～2 000m/z。

使用Masslynx 4.1软件对获取的液质结果进行分析，以获得潜在的壳寡糖信息。依据一级质谱信息进行潜在壳寡糖组分的组成分析，具体方法如下：首先建立聚合度为2～20的所有可能结构壳寡糖的H+、Na+和K+衍生物及多电荷离子的理论质荷比(m/z)数据库，如含有4个N-乙酰氨基葡萄糖(A)及8个氨基葡萄糖(D)的壳寡糖(D8A4)不同正离子衍生物及其理论m/z值包括[D8A4+H]+/2 119.9、[D8A4+Na]+/2 141.9、[D8A4+K]+/2 157.9、[D8A4+2H]2+/1 060.5及[D8A4+3H]3+/707.3等，将测定的m/z值与数据库中壳寡糖的理论m/z值对比，即可推测产物壳寡糖的潜在组成。

1.3.4 低脱乙酰度壳寡糖结构特征分析

使用液体1H NMR及13C NMR分别对制备的壳寡糖的还原端及非还原端单糖组成进行分析，具体方法：称取25 mg制备的壳寡糖冻干样品，加入0.50 mL D2O，待其充分溶解后加样检测。以3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4钠盐为内标，使用AVANCE III 600MHz型核磁共振仪对样品进行检测，其中，1H NMR检测时对水峰进行抑制以减少干扰。获得的原始数据使用MestReNova软件打开后，使用内标校正位移值后，参照文献[16]对特定部位单糖进行标记，具体的参考位移值包括1H NMR中的还原端氨基葡萄糖(-D，δ5.43)、还原端N-乙酰氨基葡萄糖(-A，δ5.19)以及13C NMR中5位碳(C5)的非还原端氨基葡萄糖(D-，δ79.0)及非还原端N-乙酰氨基葡萄糖(A-，δ78.5)等。

2 结果与讨论

2.1 壳聚糖酶基因优化、全合成及毕赤酵母表达

环状芽胞杆菌菌株MH-K1壳聚糖酶编码基因长度为906 bp，编码蛋白包含301个氨基酸，在蛋白的氨基末端包含1个信号肽。将密码子优化后的基因命名为bccsn(GenBank:MG595777)。使用酶切方法对构建好的表达载体进行验证，电泳结果见图1。由图1可知，经XhoⅠ及NotⅠ双酶切后，在750～1 000 bp附近出现了1个条带(E1)，与目的基因(813 bp)大小相符；使用BglⅡ对质粒线性化后出现了预期的2个片段(E2)，其中，10 kb附近为含有目的基因的片段，3 kb附近为含有抗性基因的片段。双末端测序结果也确认目的基因被正确构建至表达载体中。使用SDS-PAGE方法分析目标蛋白(记为BCCSN)的表达情况，结果显示，在3.5×104附近出现了1个较明显的蛋白条带(P1)，稍大于该蛋白的预测值(2.99 ×104)(图1(b))。Bradford法测定发酵上清中的粗蛋白质质量浓度为0.77 mg/mL。

图1 重组质粒酶切产物及其蛋白表达产物电泳图谱Fig.1 Electrophoresis map of recombinant plasmidrestriction enzyme hydrolysates (a) andprotein expression products (b)

在本研究之前，已有多篇针对环状芽胞杆菌MH-K1壳聚糖酶的相关报道。Yabuki等[17]最先对该酶进行纯化及鉴定，确定该酶分子量约为3.0×104；Saito等[14]对该酶的晶体结构进行解析，确定该酶水解特定糖苷键类型的结构基础；Fukamizo等[18]确定该酶蛋白序列中第218位的赖氨酸为底物结合关键氨基酸；Kouzai等[19]将该酶的基因导入水稻基因组中，证实其可增强水稻对稻瘟病的抵抗能力；Tomita等[20]

利用千叶短芽胞杆菌表达了该酶，并对其体外抗真菌活性进行了研究，但都没有研究该酶水解产物的组成及结构。

2.2 水解产物组成及结构特征分析

使用UPLC-QTOF MS对水解产物进行检测及分析，结果见图2。由图2可知，水解产物已被一定程度分离。选取其中的12个典型峰(A～L)，利用对应的质谱信息，在这些峰中一共找到37个较为明显的潜在壳寡糖组分，结果见图3。由图3可知，这些潜在壳寡糖组分的聚合度为2～20，并根据不同的脱乙酰度将这些壳寡糖的分析结果总结于表1。

由图2～3及表1结果可知：壳寡糖根据其中含有的氨基葡萄糖的数量由少至多出峰，使用的色谱柱基本能将不同氨基葡萄糖含量的壳寡糖组分分离开来；当相同氨基葡萄糖含量下出现不同数量的N-乙酰氨基葡萄糖时，该色谱柱难以对其有效分离。

结合全基因合成及密码子优化，利用毕赤酵母分泌表达系统，可以快速获得高活性的壳聚糖酶。液质分析结果显示，利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖，可以获得多种壳寡糖组分。与使用传统的高脱乙酰度壳聚糖底物相比，改用低脱乙酰度底物获得的产物壳寡糖组分更加多样。

2.3 水解产物结构特征分析

为获得壳聚糖酶对底物的位点识别特性及产物的结构特征，进一步使用1H NMR及13C NMR对水解产物进行鉴定，结果见图4。由图4可知：水解产物的还原末端主要由氨基葡萄糖组成(图4(a))，而非还原末端则同时含有氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖(图4(b))。上述结果说明该酶可同时水解糖苷键GlcN-GlcN及GlcN-GlcNAc，与Ⅲ型壳聚糖酶底物识别特性相符。

图2 BCCSN酶解产物总离子流图(TIC)Fig.2 TIC of BCCSN hydrolysis products

图3 BCCSN酶解产物质谱Fig.3 Mass spectrogram of BCCSN hydrolysis products

序号保留时间/min实测m/z理论m/z推测组成A110.27341.4341.1[D2+H]+B112.28544.6544.2[D2A1+H]+C116.10502.5502.2[D3+H]+D117.40705.8705.3[D3A1+H]+E118.69909.0908.4[D3A2+H]+F121.76866.9866.4[D4A1+H]+F221.761 070.11 069.4[D4A2+H]+G122.99637.2636.8[D4A3+2H]2+H125.16514.6514.2[D5A1+2H]2+H225.16616.2615.8[D5A2+2H]2+H325.16717.8717.3[D5A3+2H]2+H425.16819.4818.8[D5A4+2H]2+I127.56696.8696.3[D6A2+2H]2+I227.56798.3797.8[D6A3+2H]2+I327.56900.0899.4[D6A4+2H]2+I427.561 001.61 000.9[D6A5+2H]2+I527.561 103.21 102.4[D6A6+2H]2+J130.24878.9878.4[D7A3+2H]2+J230.24980.5979.9[D7A4+2H]2+J330.241 082.21 081.4[D7A5+2H]2+J430.241 183.81 183.0[D7A6+2H]2+J530.241 285.31 284.5[D7A7+2H]2+K131.69707.7707.3[D8A4+3H]3+K231.69775.5775.0[D8A5+3H]3+K331.69843.2842.7[D8A6+3H]3+K431.69911.0910.4[D8A7+3H]3+K531.69978.7978.1[D8A8+3H]3+L132.87761.5761.0[D9A4+3H]3+L232.87829.2828.7[D9A5+3H]3+L332.87897.0896.4[D9A6+3H]3+L432.87964.7964.1[D9A7+3H]3+L532.871 032.41 031.8[D9A8+3H]3+L632.87950.7950.1[D10A6+3H]3+L732.871 018.41 017.7[D10A7+3H]3+L832.871 086.21 085.4[D10A8+3H]3+L932.871 153.91 153.1[D10A9+3H]3+L1032.871 221.61 220.8[D10A10+3H]3+

注：D代表氨基葡萄糖，A代表N-乙酰氨基葡萄糖，随后的数字代表对应单糖的数量。

图4 酶解产物1H NMR(a)及13C NMR(b)分析Fig.4 1H NMR (a) and 13C NMR (b) spectra of hydrolysis products

与动植物的特定受体结合并激活免疫等下游信号通路，是壳寡糖发挥生物活性的重要方式。研究发现，在动植物细胞中存在多种可识别壳寡糖链上N-乙酰氨基葡萄糖的特异性受体[21-27]。这些受体是否可以与低脱乙酰度的复杂结构壳寡糖结合以及何种结构壳寡糖可以激发最大的生物学活性等问题都缺乏系统研究。我们将进一步对特定结构壳寡糖进行制备及分离，以期为其结构与功能研究及新型壳寡糖产品开发提供前提及参考。

3 结论

利用毕赤酵母分泌表达环状芽胞杆菌壳聚糖酶并使用该酶水解制备了低脱乙酰度壳寡糖。组分及结构分析结果显示，这些壳寡糖的聚合度为2～20，可以获得不同脱乙酰度的组分，寡糖链的还原末端主要由氨基葡萄糖组成，非还原端同时含有氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖。与传统壳寡糖相比，本研究制备的壳寡糖组分更加复杂多样，可能具有更高或者新的生物活性。