脑缺血再灌注损伤分子生物学机制及现代中医药治疗进展

雷梦南，李 玉，胡建鹏

（安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室，合肥 230038）

脑血管病（CVD）泛指脑部血管的各种疾病，是当今世界三大疾病之一。缺血性脑血管病（ICVD）的死亡率在人类疾病中居第二位，约占80%～85%[1]。脑缺血一段时间后，血供功能不仅不能恢复，而且还会出现更严重的脑功能障碍现象，称为脑缺血再灌注损 伤（cerebral ischemia-reperfusion injure, CIRI）。CIRI的病理生理过程属于一个多因素参与、多环节循环、多途径损伤的酶促级联反应[2]。现今认为CIRI的发病机制主要与自由基损伤、兴奋性氨基酸中毒、细胞Ca2+超载及凋亡等方面有关，且机制尚未明晰。笔者结合各种CIRI动物实验基础研究和CIRI相关现代中医药防治，为进一步探索CIRI的机制与治疗提供了理论依据。

1 CIRI 分子生物学机制

1.1 自由基作用 CIRI产生的主要机制之一是自由基的作用[3]。自由基是广泛存在于生物体内的“活性氧成分”，主要包括非脂性自由基、脂性自由基、活性氧、其他脂质过氧化物等[4]。大量过氧化物产生于脑缺血损伤形成过程中，其中可反映部分细胞损伤程度的是过氧化物MDA的过氧化水平[5]。在脑缺血组织中，大量自由基、活化氧被神经元释放。抗氧化酶类合成发生障碍无法清除过量的自由基，过多活性氧同样不能被清除，自由基对脑组织的损伤逐步上升，主要变现为染色体畸变，核酸碱基改变或DNA断裂。组织细胞中开始出现线粒体质膜损伤，线粒体功能障碍进一步加重[5]，细胞氧化应激损伤随之加重，一系列生物活性物质被释放造成脑组织细胞凋亡[6]。

1.2 兴奋性氨基酸（excitatory amino acids, EAAs）毒性学说 EAAs是指具有2个羧基和1个氨基的酸性游离氨基酸，主要包括谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、乙酰胆碱及羧甲基-3-异丙烯基脯氨酸等[7]，是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质,在神经元信息传递中发挥重要作用。生理状态下，维持细胞正常生理活动运转的是适量EAAs，而EAAs明显增多在脑缺血形成过程里，EAAs受体的活化进一步增强[8]，过量的EAAs对神经系统具有神经毒性作用，是引起 CIRI 的重要途径之一[9]。

1.3 细胞内 Ca2+超载 细胞内Ca2+的集聚受钙通道和内质网、线粒体在内的异常活跃隔离系统的调控配置[10]。生理状况下，细胞外Ca2+浓度高于细胞内约万倍，参与相关的神经调节及传递。脑缺血时，由于Ca2+超载，蛋白激酶C被激活，加重了脑缺血缺氧的进程，影响DNA 裂解和轴突传递的进程，造成水肿和脑血管功能障碍等多方面的异常改变，从而导致脑细胞的不可逆死亡[11]。线粒体内钙超载诱导多种线粒体蛋白的去磷酸化，可抑制ATP合成；线粒体功能障及酶的活化作用及不可逆的神经细胞损伤的出现,是钙超载影响 CIRI 的主要因素[12]。

1.4 血-脑脊液屏障（blood brain barrier, BBB）的破坏 位于脑室脉络丛的上皮细胞、基底膜及星形胶质细胞共同组成了血-脑脊液屏障，其中的脑毛细血管基底层主要由Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白等构成，是维持BBB完整性的重要结构基础[14]；进而选择性通透了脑组织液和脑脊液之间的物质交换，脑内外机制环境得以保持稳定[13]。脑缺血再灌注后，大量的白细胞浸润及蛋白水解酶的产生，损伤了微血管内皮细胞的密切连接，升高基质金属蛋白酶的表达，改变了BBB 通透性,致使脑缺血再灌注损伤的进一步加重[15]。同时，ATP的不足、细胞内K+水平增加、乳酸酸中毒、细胞外谷氨酸的释放等因素均使 BBB 的破坏加剧[16]。

1.5 神经细胞凋亡 凋亡是CIRI神经元损伤的形式之一，是体内外因素触发细胞内预存的死亡程序受多种相关基因的影响而导致细胞死亡的复杂的病理生理过程，其具体的机制尚未完全清楚。资料表明细胞色素C、Bcl-2家族、P53蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、内源性核酸内切酶、组织型转谷氨酰胺酶等相关调控基因与细胞凋亡关系最密切[17]。脑缺血发生时，由缺血所引起的Fas信号转导通路的异常 、产生增多的Tat蛋白、EAAs 等使凋亡基因的表达升高，造成脑细胞的凋亡[18]。

2 CIRI现代中医药疗法

2.1 中药 近年研究显示，多种中药及其有效成分提取物对脑缺血再灌注损伤有保护机制，主要表现为减缓细胞膜损伤，降低Ca2+超载造成的细胞不可逆损伤、抑制白细胞的聚集、清除过量的自由基、抑制中性粒细胞与血管内皮细胞的交互作用，影响基因表达与细胞凋亡调控等方面。

2.1.1 单味中药及提取物 1）夏天无注射液（ICDP）。徐祖才等[19]应用TTC染色检测大鼠脑组织梗死体积，免疫组化技术测定脑组织的磷酸化NF-κB表达水平。TTC检测显示，剂量不同的ICDP都可以降低相应组别大鼠的脑梗死的重量百分比；免疫组化染色显示，磷酸化 NF-κB 主要集中表达在海马区核中，而少量在CA3 区表达。结论： ICDP 能显著降低缺血区脑损伤，显著降低脑组织磷酸化NF-κB 蛋白表达，其机制可能与NF-κB 信号转导通路的神经保护作用及信号通路减弱有关。2）川芎嗪。李鹏飞等[20]采用改良Zea Longa栓线法构建大脑中动脉梗塞模型，苏木素伊红（HE）染色检查脑组织病理学改变，TTC染色法检测大鼠脑梗死体积，实时定量PCR检测大鼠梗死侧脑皮层的Bcl-2、肿瘤坏死因子 、白细胞介素（IL）-1β的表达水平；免疫组化法验证大鼠梗死侧脑皮质核转录因子及磷酸化NF-κB P65的表达。实验表明：TMP治疗可以改善大鼠神经功能，使脑细胞含水量下降，显著改善脑水肿、减少脑梗死面积以及改善脑部神经组织的损伤，从而表明TMP具有一定保护脑神经的机制，进一步抑制脑缺血的神经细胞凋亡，降低再灌注所致脑组织结构的损伤可能性。3）无患子皂苷。刘金林等[21]将大鼠随机分组，采用线栓法复制脑缺血再灌注模型。结果显示，无患子皂苷可降低炎性介质血清TNF-α 含量、降低炎症细胞的强烈趋化因子IL-1β 含量、降低脑组织细胞黏附因子 ICAM1 含量，来抑制脑缺血再灌注损伤过程中的炎症反应，以减少脑组织的回流血量，从而减少脑内组织自身炎性介质的释放，阻断再灌注后炎症级联反应，改善缺血后继发性脑损伤。

2.1.2 中药有效成分 1）红景天苷。王军等[22]通过实验来测定受试大鼠脑梗死体积，用PCR法检测8-二氧基应激产物的表达水平，用定量RT-PCR测定提取mRNA进行反转录基因表达水平变化。红景天苷具有清除自由基、保护受损的脑组织等功能[23]，实验表明：红景天苷可提高脑组织中的c-hif-1表达，对脑组织缺血再灌注损伤的抗损伤作用，减少再灌注所诱导氧化应激的发生[24]。2）葛根素。LIU等[25]将行中脑动脉闭塞（MCAO）法制备大鼠脑缺血模型，脑部梗死体积由TTC测定。研究表明，葛根素对大鼠缺血性脑损伤部分神经元细胞有保护机制，可降低缺血性脑梗死体积，改善脑后神经缺损缺血/再灌注，降低了白细胞介素-1β、白细胞介素- 6和肿瘤坏死Factor-α的表达，从而能有效促进大脑抵抗脑缺血再灌注损伤，并抑制炎症反应。3）黄芪甲苷和三七。黄小平等[26]将大鼠随机分组，采用RT-PCR方法测定葡萄糖转运蛋基因和脑组织蛋白质表达。实验结果表明，黄芪、三七活性成分能显著改善脑缺血再灌注损伤后脑能量代谢，显著提高缺血脑组织能量物质利用率。经配伍后，缺血后组织能量代谢有良好的调节作用。

2.1.3 中药复方及中成药 1）补阳还五汤。关莉等[27]实验结果表明，补阳还五汤可预防大鼠脑缺血再灌注所致的GluR2表达下降，保护脑组织，从而抑制脑神经元的凋亡。2）清热化瘀Ⅱ号方。祝美珍等[28]经研究表明，清热化瘀Ⅱ号方可能通过减少TLR4-TRAM信号通路的传导途径，减少神经元损伤，减少了其通路的表达，降低炎症级联现象。此外，还可保护大鼠脑缺血再灌注损伤的脑细胞[29]。

2.2 针灸治疗 针灸可以减轻脑组织的抗氧化应激，使脑血管的舒缩功能得以缓解，使脑缺血再灌注后细胞坏死与凋亡得到抑制，改变了再灌注的BBB 结构后，疏通脑缺血细胞的能量供应及代谢，保护再灌注后的脑组织。CHEN等[30]采用针刺百会和足三里穴位来检测脑缺血再灌注大鼠的外周血清（miRNA124）和层黏连蛋白，整合素β1的水平。实验结果表明：外周血中（miRNA124）显著升高，且该作用随时间的延长而更为明显，层粘连蛋白的表达在缺血再灌注组要高于假手术组，整合素β1的水平在针灸组的表达要低于模型组。针刺百会和足三里可以缓解大鼠的脑缺血区域的细胞损伤，上调外周血清的（miRNA124）、层黏连蛋白及整合素β1的水平，其炎症反应的介导得到缓解，进而发挥其在脑保护中的作用[31]。

3 小结

近年来，虽然CIRI的预防和治疗得到了较大的改善，但目前来看，存在以下不足：1）有关脑缺血再灌注损伤的具体的分子生物学机制没有得到一致的衡量标准，而实验测量方法标准不一，实验设计无创新性，而且关于脑缺血再灌注的模型制备没有较为统一的标准；2）中药复方的研究中，中医药特色配伍规律未展现，其配伍优势没有得到良好发挥。

针对以上不足，建议：1）在基因分子视点上，深入探究CIRI分子生物学机制，采用标准统一的实验测量方法，运用国际上较统一的实验动物模型制备方法；2）在研究单味中药及其有效成分的作用机制基础上，需要加强研究中药复方的主要成分间相互影响，从而使君、臣、佐、使在其得到充分的展现，以期在 CIRI分子生物学机制的深入研究及现代中医药预防治疗方面细究具有重要的创新价值。