全氟己烷磺酸暴露影响小鼠肠道菌群组成的初步研究

张兴桃,王海潮,徐礼生,章志远

宿州学院生物与食品工程学院,安徽宿州,234000

全氟己烷磺酸(Perfluorohexane sulfonate,PFHxS)属于一种全氟化合物，具有疏油、疏水和极低表面张力等特殊理化性质，广泛应用于日用品的制造，如食品包装物、不粘炊具等[1]。近年来，随着人们环保意识的的提高，有关PFHxS毒理的研究受到了越来越多的关注。已有研究表明PFHxS是自然界中存在于人体代谢周期最长的全氟化合物质，且已在人血清，精液和母乳中检出，浓度有逐年增高的趋势，因此对人类存在潜在健康风险[2-3]。PFHxS具有一定的发育神经毒性和肝脏毒性[4]， Iwa Lee等发现初生小鼠PFHxS暴露后对脑神经蛋白发育产生了不利影响[5]；Henrik Viberg等发现PFHxS暴露与小鼠行为与认知功能紊乱相关[6]；Youn 等则揭示PFHxS暴露后激活ERK1/2介导的信号通路，诱发神经细胞的凋亡[7]。

肠道菌群的变化与机体功能紊乱存在一定的相关性，已成为当前生物学研究热点之一，也是某些特定疾病研究的突破口[8]。肠道菌群是机体肠道的重要组成部分，与人体健康、疾病发生等密切相关[9]。王丽凤研究发现肠道中微生物的变化和粪便菌群构成显著相关，因此研究粪便菌群，可为研究解肠道菌群提供便利[10]。而培养基培养等传统的研究方法等局限于某些特定微生物，低估了菌群的数量和多样性，不能充分反映肠道菌群的变化[11]。目前，分子生物技术如变性梯度凝胶电泳、聚合酶链式反应、克隆文库构建等已经广泛运用到微生物群落分析中。高通量测序技术具有准确定量、实时检测等较为明显的优势[12]，已广泛应用于微生物群落结构研究。本研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术，结合生物信息学分析技术分析测序数据，旨在分析PFHxS暴露对小鼠肠道菌群结构组成、菌群多样性和丰度等变化，探索PFHxS暴露下小鼠肠道菌群的组成变化，探究肠道菌群改变与机体特定功能紊乱之间的关联性。

1 材料与方法

1.1 材料与主要仪器

1.1.1 材 料

SPF级Balb/c小鼠(购自上海思捷实验动物有限公司)、鼠粮、垫料等购于南京青龙山动物饲养场；PFHxS(Sigma-Adrich,>98.5%)；FastDNA© Spin Kit for Soil(MP Biomedicals，USA) 。

1.1.2 主要仪器

PCR仪(T100,Bio-RAD)、荧光化学发光系统(FluorChem HD2,Alfa)、超微量分光光度计(NanoDrop2000,NanoDrop)、高速冷冻离心机(1-15K,Sigma)等。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠驯化、染毒处理

SPF级Balb/c 小鼠40只，5周龄，体重18～22 g，室温 维 持 (22±2) ℃，相对湿度为40%～60%，12 h昼夜循环，自由饮水和采食，提供Milli-Q纯水和清洁级标准鼠粮，暴露前驯化7 d。实验分4组，即对照组和实验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，每组小鼠10只，分笼饲养，每天称重后计算暴露量。实验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ灌胃暴露剂量分别为PFHxS 0.02 mg/Kg·d-1，0.1 mg/Kg·d-1，1.0 mg/Kg·d-1；对照组灌胃暴露同体积去离子水，连续暴露28 d。

1.2.2 小鼠粪便的收集

暴露28 d后，收集各组小鼠新鲜粪便，放置于干燥无菌的PP离心管中， 保存于-20℃冰箱。

1.2.3 总DNA提取

采用Soil DNA Kit试剂盒提取各组小鼠粪便中菌群的总DNA，超显微紫外分光光度计法测定DNA 浓度与纯度，确定提取的DNA质量，DNA样品放置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.4 Illumina MiSeq测序和生物信息学分析

设计带有barcode扩增16S rDNA V3-V4的特异引物， PCR特异扩增；PCR产物经纯化后，送往江苏中宜金大分析检测公司进行MiSeq测序。测序得到的Raw Data利用Mothur软件进行DNA序列拆分处理；利用Qiime软件对数据进行拼接与初步降噪；通过Mothur软件去嵌合体等步骤后，得到fasta格式序列文件即有效数据，划分OTU (Operational Taxonomic Unit)；将数据上传至RDP数据库平台，利用RDP下的细菌功能模型，对样品序列进行物种分类学分析，计算出样品的稀释性曲线(Rarefaction curves)，丰富度指数(Chao1指数)、多样性指数(Shannon指数)、覆盖率指数(Coverage指数)等。

2 结果与分析

2.1 PFHxS暴露造成的小鼠体重的变化

在暴露的0～21 d中， PFHxS对小鼠体重的影响不明显。21 d后，最高浓度组小鼠体重出现下降的趋势；28 d后，最高浓度组的小鼠体重与对照组相比产生显著差异(p<0.05)；而其他暴露剂量组与对照组相比，在28 d的暴露周期中均没有表现出显著体重差异(图1)。

图1 PFHxS暴露造成的小鼠体重变化

2.2 肠道菌群多样性分析

通过Qiime软件计算样品的OTU(Operational Taxonomic Unit)数量 (相似水平97%以上),并利用OUT值用来衡量样品物种的丰度。测序数据的 Coverage值(测序深度，即覆盖率)均高于0.899以上，对照组在0.89以上，表明样品的测序深度满足分析要求。暴露后各组小鼠的肠道菌群的数均增加，实验Ⅱ组样品OTU数量最高，为1 087 (表1)。但Alpha多样性分析表明，暴露组小鼠肠道菌群的多样性低于空白对照组，但 PFHxS暴露浓度越高肠道菌群的多样性越低；Shannon指数越大表示群落多样性越高，4组样品中空白对照组的Shannon值较大为6.43， PFHxS浓度组次之，中、高浓度暴露组Shannon值均在3.36～4.41之间。与对照组相比，实验组Chaol值和Shannon指数差异均显著(p<0.05)。

表1 各组样品肠道菌群多样性分析

注：*P<0.1,**P<0.05。

2.3 肠道菌群构成分析

分析样品群落结构(图2)，结果表明门水平4组样品的菌群组成以拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria) 3个门为主，所占比例高于90%。其中，厚壁菌门(Firmicutes)在所有样品中所占比例相近，占全部菌群的25%～30%；拟杆菌门(Bacteroidetes)对照组比例最低，为44.7%，暴露组比例均增加，分别达57.6%、52.4%、53.4%；变形菌门(Proteobacteria) 对照组比例最高，占18.4%，暴露组分别降低了5.37%、12.4%、9.97%；同时，PFHxS暴露也影响放线菌门(Actinobacteria)、柔壁菌门(Tenericutes)的丰度，但与对照组相比差异不显著。

图2 小鼠肠道菌群结构图(在门分类水平上)

在属水平上，对照组中的菌群主要有普氏菌属(Prevotella)、杆菌属(Odoribacter)、拟杆菌属(Parabacteroides)、类杆菌属(Bacteroides)等多个属，其中普氏菌属占菌群总量36.8%，4属菌群约占总量的79.3%(表2)。

表2 肠道菌群在属水平上的物种丰度

PFHxS暴露处理后，属水平菌群组成比例发生了明显改变，其中Prevotella比例对照组为25%，最高暴露组为51%，但中、低剂量组均未检测到；Bacteroides、乳酸杆菌属比例均随暴露剂量增加而增加，最大暴露剂量组为28.1%；Lactobacillus最大暴露剂量组为8.1%；Lactobacillus、Prevotella和Bacteroides都与机体糖脂代谢有关，其菌群比例的改变可能与机体糖脂代谢功能紊乱存在一定的联系(图3)。

图3 样品在属分类水平上丰度的热图

通过高通量分析小鼠肠道菌群结构，揭示PFHxS暴露对小鼠肠道菌群的影响。选取瘤胃球菌属(Ruminococcus)、Lactobacillus、Parabacteroides、Bacteroides、Prevotella等 5种与糖脂代谢相关的细菌，通过PFHxS暴露前后丰度的变化，初步分析PFHxS暴露下小鼠糖脂代谢功能紊乱与肠道菌群变化的关联性。暴露后，Bacteroides、Prevotella丰度变化明显，Lactobacillus高浓度暴露组与对照组差异明显(图4)，初步表明PFHxS暴露可能会造成糖脂代谢功能紊乱。

图4 糖脂代谢有关的菌群丰度分布

3 结 论

本研究表明拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门为小鼠肠道的主要菌群；经PFHxS暴露的小鼠肠道菌群的多样性明显高于空白对照组，最高暴露组OTU数量最高，为1 087。在门的水平上，Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria等为肠道优势菌群，占比达90%以上；其中拟杆菌门在空白对照组中所占比例最低，随着PFHxS暴露剂量的提高呈上升趋势。对照组的肠道菌群主要包含Prevotella、Odoribacter、Parabacteroides、Bacteroides等多个属，但 PFHxS暴露处理后，属水平上小鼠的肠道菌群结构发生了明显改变，其中Prevotella对照组为25%，最高暴露组增加到51%，但中、低剂量组均未检测到；Bacteroides、Lactobacillus比例均随暴露剂量增加而增加，Bacteroides最大暴露剂量组最高，为28.1%；Lactobacillus最大暴露剂量组为8.1%。