诱导多能性干细胞重编程方法及应用研究进展

卢电 谢英俊 孙筱放

广州医科大学附属第三医院妇产科研究所实验部，广东省产科重大疾病重点实验室，广东省普通高校生殖与遗传重点实验室（广州510150）

诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）是通过在已分化的体细胞中表达特定的基因或特定基因产物等方式，以诱导体细胞的重编程而获得可不断自我更新且具有多向分化潜能的细胞。自2006年日本科学家YAMANAKA［1］报道通过外源表达4 个转录因子Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc（称为OSKM 因子）能够将体细胞重编程为类似于胚胎干细胞的iPSC 以来，该技术成为了再生医学领域的又一研究热点。近年来，随着该领域研究的持续深入，研究方法的日益更新，人类iPSC 研究得到了蓬勃的发展。

目前国内外对iPSC 研究的热点一直集中在技术上如何实现对分化成熟的终末细胞高效安全地向iPSC 的成功转化，如国内中科院裴端卿团队突破性利用尿液脱落细胞诱导成iPSC，其随后更发现维生素C 可提高多能性干细胞的诱导效率达100 倍之多［2］。另外近年来，学术界对iPSC的话题则聚焦在对其临床应用（如疾病模型，干细胞疗法和组织器官再生）的安全性及有效性的探讨；我国《十三五国家战略性新兴产业发展规划》（2016-2020）明确要求“构建基于干细胞与再生技术的临床医学新模式，持续深化干细胞与再生技术临床应用”。基于此，本文主要在回顾iPSC 研究历程的基础上，对近年iPSC 重编程方法的革新及其临床应用进行综述。

1 重编程载体的选择

自从2006年鼠iPSC 和2007年人iPSC 成功获得以来［1，3］，研究人员一直在努力优化重编程因子在细胞中的传递方法。在早期的实验中，基因组整合病毒逆转录病毒是最常见的载体，由于一般的逆转录病毒感染细胞依赖于细胞分裂状态，因此相对而言，对分裂和非分裂细胞均有感染作用的慢病毒用于重编程的细胞范围更加广泛［1，3］。虽然基因组整合病毒载体的方法为iPSC 的生成提供了最初的技术，但其随机整合现象可能导致插入突变，干扰内源基因的表达调控或在终末分化的细胞中被异常再激活。因此，研究者陆续开发了几种非基因整合型的重编程方法。经典的非整合型载体仙台病毒和腺病毒可介导转录因子基因在宿主细胞中瞬时表达，诱导细胞产生多潜能性，获得无病毒整合的iPSC［4-5］。此外，人类体细胞来源的iPSC 克隆亦可通过质粒、piggyBac 转座系统、微环载体等［6-8］载体对体细胞进行重编程获得，然而，使用这些载体的重编程效率比较低。近年来，非核酸类载体重编程方法研究也有了重大进展。经修饰的mRNA、microRNA［9］和纯化的重组蛋白已成功地将小鼠和人的成纤维细胞培养成iPSC。GUO 等［10］尝试利用重组细胞穿透蛋白OCT4/KLF4/SOX2（PTD-OKS）和小分子混合物（VCFZ）进行非遗传载体类重编程，成功地将人脂肪源性干细胞诱导为iPSC。非核酸类载体重编程方法不涉及外源性基因的强制表达，其诱导细胞的特征之一是低致瘤性，但是否真的低于转录因子转化的细胞尚未清楚。这需要将化学诱导的细胞移植到动物模型中，进一步在体内评估其致瘤性。

目前，重新编程技术的最新进展集中于开发一种新方法，即不需要重编程因子进入细胞就可实现iPSC 的成功转化。例如BLANCHARD 等［11］发现了一些能够刺激细胞内通路的抗体，这些通路最终会同重编程因子一样激活靶基因。用这些对细胞表面起作用的抗体取代重编程中使用的转录因子，避免了c-Myc 等具有潜在致癌风险的基因进入细胞，并且消除了外来遗传物质随意整合到基因组而破坏功能基因或激活致癌基因的可能性。尽管重编程技术目前面临诸多技术难题，但随着分子生物学与细胞生物学的迅猛发展，这些问题将有望得到破解。

2 重编程效率的提高和多能性的维持

虽然非整合病毒载体和质粒等直接转染均可重编程体细胞，但这些非整合型途径所介导的重编程效率比整合型载体介导的重编程效率低几个数量级。目前已经发现了许多可以提高重编程效率的小分子，有些小分子甚至可以替代重要的重编程因子［12］。大量证据表明，包括培养基质和邻近细胞在内的不溶性微环境直接调控核心多能基因的表达和染色质的表观遗传修饰，从而影响重编程动力学。

2.1 小分子提高重编程效率 科学家研究了由Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc 控制的多潜能相关基因调控网络和相关生物过程。这些研究揭示了先天免疫、自由基生成活性氧反应、缺氧、氧化DNA 损伤、p53 活化、衰老、凋亡、上皮间充质转化和表观遗传修饰等与iPSC 的生成效率和多能性的维持紧密相关。通过调节上述生物代谢过程、信号通路和表观遗传修饰相关的可溶性和非免疫原性小分子可以优化重编程过程［13］。用Rho 相关激酶（ROCK）抑制剂Y-27632 预处理植入前的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞，能提高急性心肌梗死小鼠模型中心肌细胞的存活和移植［14］。LI 等［15］的研究表明，一种包含了cyclic pifithrin-a（p53 抑制剂）的分子复合物可以显著提高人尿路来源细胞的重编程效率（170 倍以上）。

2.2 细胞外环境的优化 除了上述的可溶性分子外，不溶性微环境，包括培养基物理化性质和邻近细胞的相互影响，对细胞的功能和命运也起着决定性的作用。

培养基质的表面形貌直接影响细胞黏着斑的形成和细胞骨架的结构和收缩性，进而触发胞内信号级联事件，影响下游基因表达、细胞形态、贴壁、增殖、迁移和分化等一系列表型。KO 等［16］发现在培养皿上涂布规则纳米颗粒有助于维持iPSC 的多能性，并在无饲养层细胞共培养的条件下促进iPSC 的增殖。WORTHINGTON 等［17］采用双光子聚合技术打印不同特征尺寸的拓扑图形，研究培养皿表面形态其对iPSC 分化的影响。他们发现与表面平滑的培养皿相比，小拓扑特征尺寸（1.6 μm）的培养表面促进iPSC 向外胚层分化，而大拓扑特征尺寸（8 μm）的培养表面抑制细胞自我更新。这些结果表明，微形态学介导的表观基因组重构可能有助于克服体细胞重编程目前的难题。

小鼠和人类干细胞的多能性受基质硬度的调节。稳定诱导多能性干细胞在无外源条件下的培养对产生临床级治疗细胞至关重要。CHEN 等［18］的研究结果表明，水凝胶的设计和细胞结合域的表面密度对于促进人类胚胎干细胞和iPSC 的增殖以及在长期无外源培养条件下维持这些细胞的多能性具有重要意义。据报道，将OSKM因子转导后的鼠胚胎成纤维细胞培养在较软的水凝胶（100 Pa）上，与更硬的水凝胶（≥1 kPa）相比，重编效率提高了两倍。软基质通过激活上皮细胞-间充质细胞转化和增强多能性标记物的表达促进细胞重编程［19］。同样，将鼠胚胎成纤维细胞嵌入到不同力学性能的三维水凝胶中培养，发现硬度较小的水凝胶具有较高的重编程效率［20］。

细胞间相互黏附对于多能性干细胞生存和多能性维持有着举足轻重的作用。在iPSC 传代过程中，通常利用温和的蛋白质水解酶或者是机械力将细胞分散成小团以保护细胞间黏附。不同的细胞间相互作用驱动多种干细胞反应，包括促进增殖和自我更新以及诱导分化等［21］。Rho 相关激酶抑制剂Y-27632 通过减弱肌动蛋白-肌球蛋白之间的收缩，避免肌动蛋白-肌球蛋白的过度收缩引起的细胞凋亡，从而提高急性心肌梗死小鼠模型中心肌细胞的存活和移植［12］。然而针对iPSC 重编程效率的提高和多能性维持的研究仍有赖于多学科领域的专家进行通力合作，以有望在不久的将来得到解决。

3 iPSC 在疾病模型中的应用

iPSC 的临床应用现在处于再生医学研究的最前沿并且可以分为3 类：疾病模型（用于疾病机制的研究和罕见病药物筛查的研究），干细胞疗法和组织器官再生。

在疾病建模应用中，iPSC 为理解人类疾病的遗传基础提供了一种非常宝贵的模型系统。利用诱导多能干细胞建立疾病模型的优势在于：其携带与病人完全相同的遗传物质，具有与胚胎干细胞类似的克隆形成能力、自我更新和多能分化潜能，而且克服了临床上特定细胞取材在伦理和技术方面的限制。目前，最常使用的动物模型不但涉及伦理问题且与人类存在遗传背景、生理及药物代谢等方面的差异，因此难以用来充分阐明人类疾病背后的详细分子机制。iPSC 技术代表了一种新方法，它们可以扩增到非常大的数量并直接分化生成各种疾病的患者特异性组织模型，并且可针对不同患者建立特异性iPSC 疾病模型，筛选出具有针对性的药物，真正实现个体化治疗。目前，神经系统疾病［22-23］、心血管疾病［24-25］、呼吸系统疾病［26-27］、血液系统［28］、泌尿系统疾病［29］、肝病［30］和眼科疾病［31］等许多疾病特异性的iPSC 细胞系已被成功建立，这些细胞可用于临床疾病治疗，药物开发和基础研究。LANG 等［22］对携带帕金森疾病风险变异的iPSC 诱导的多巴胺神经元进行高分辨率单细胞转录组学分析，重建了由基因表达改变导致的内质网应激反应轴，并发现去乙酰化酶4 是帕金森疾病进展的上游调节因子。人iPSC 分化的心肌细胞与目前的原代心肌细胞模型相比，心肌细胞形态结构和收缩力没有显著差异，并对大多数作用于心脏的药物有类似反应［25］。SUGIMURA 等［28］首次利用7 个转录因子，将成体细胞来源的iPSC 转化为造血干细胞，其与天然造血干细胞具有十分相似的特性。这种造血干细胞在模拟人类遗传性血液病，以及评估基因治疗载体或药物恢复造血功能的疗效方面具有广阔的前景。为了了解乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的感染机制并开发有效的抗HBV药物，SAKURAI 等［30］建立一个iPSC 诱导来源的肝细胞样细胞（iPSC cell-derived hepatocyte-like cells，iPS-HLCs）模型。在接种HBV 后，iPS-HLCs 中HBV 蛋白和病毒RNA 表达显著升高，抗HBV 药物恩替卡韦等能显著抑制iPS-HLCs 中HBV 的感染，这说明iPS-HLCs 可以模拟体外HBV 感染状态。SA 等［27］将诱导多能干细胞分化的内皮细胞、特发性肺动脉高压患者的肺动脉内皮细胞与正常对照组进行比较，其粘附、迁移、存活和管形成能力均有相似程度的降低，BMPR2 和下游信号通路及胶原蛋白IV 表达均降低，且两者对弹性蛋白酶抑制剂ElafinElafin 和免疫抑制剂FK506 的反应类似，这些研究表明诱导多能干细胞来源的内皮细胞为特发性或遗传性肺动脉高压病后续治疗药物筛查提供了一种良好的供体。

4 iPSC 的干细胞疗法

在干细胞治疗应用中，分离的iPSC 中的遗传缺陷可首先通过基因靶向治疗，然后诱导细胞分化为目标祖细胞或功能细胞，这些自体细胞可以通过不同的方法传递到患者的损伤部位，以加速组织修复。老年性黄斑变性和相关的黄斑营养不良是导致视力丧失的主要原因。2014年，REARDON 等［32］进行了第一次基于iPSC 疗法的人体试验，他们将病人iPSC 来源的视网膜色素上皮层植入70 岁患有老年性黄斑变性的女性患者的右眼。该疗法阻止了患者的黄斑变性并改善了视力。但是，随后的临床试验因第2 例患者来源的iPSC 发生了两个基因突变而被推迟［33］。2017年3月，MANDAI 等［34］将诱导多能性干细胞来源的视网膜色素上皮细胞片成功移植于患者黄斑下，并在术后1年证实了移植的有效性和安全性，尽管囊性黄斑水肿仍然存在，但患者最佳矫正视力已稳定，这表明iPSC 细胞疗法至少延缓了该疾病的退行性影响。最近的一项临床前试验表明，人类iPSC 细胞来源的中脑多巴胺能祖细胞在神经毒素MPTP 处理的灵长类帕金森疾病（parkinson′s disease，PD）模型中存活下来并发挥作用，经过2年的观察，组织学研究表明与健康个体一样，成熟的多巴胺能神经元将致密的神经突延伸至宿主纹状体，根据分数分析和录像记录，移植后猴子的自发运动增加，而且移植物没有引起明显的免疫反应，也没有在大脑中形成肿瘤。这项使用灵长类动物模型的临床前研究表明，人类iPSC 细胞来源的多巴胺能祖细胞有望在临床上用于PD患者的治疗［35］。虽然iPSC 在临床治疗上具有极大的前景，但真正在临床上实现该疗法还存在许多障碍需要跨越，如培养方案、移植方法、肿瘤原性和免疫原性的安全性保证等。

5 iPSC 在组织或器官再生中的应用

组织或器官再生应用探索了iPSC 的多谱系分化潜能，通过在合适的细胞外微环境中加入特定生物物理和生物化学诱导因子，使细胞诱导分化为有功能的三维组织或器官。与二维单层细胞模型不同，三维类组织器官经历了多谱系分化，形成异质细胞群，自我组织形成复杂的组织样结构，从而建立一个与二维培养相比在生理学上更接近疾病原型的微环境［36］。此外，由于从iPSC 获得的三维类器官可在体外培养，并且可以操纵其小环境成分，如信号通路、转录和翻译调控因子等，因此比动物模型在模拟人类疾病方面更具优势。在心血管方面，有文献报道了一种生物三维打印血管化组织模型，为药物管理和毒性分析提供了相比于二维培养细胞更精准的模型［37］。HALE 等［36］建立了诱导多能干细胞来源的可以体外模拟人足细胞病和筛选足细胞毒性药物的三维人体肾小球类器官。AMIRI 等［38］证明了iPSC 来源的类器官可以在分子水平上模拟胎儿5 到16 周大脑皮层的发育状况。当然，因为目前几乎无法人为控制细胞如何自组织成类器官，所以这些研究产生的类器官不能保证外形尺寸、细胞组成、表型和分子特征的精确复制，因此难以进行治疗质量和安全性控制［39］。虽然最近在更好地控制类器官来源和标准化方面取得了进展［40］，但要实现严格的规范制造还需要更多的努力。

综上，iPSC 不仅具有类似于胚胎干细胞的无限增殖和分化多能性特征，而且突破了胚胎干细胞的免疫排斥和伦理问题等应用限制，为人类医疗手段突破现有的瓶颈提供了解决方案。目前，虽然iPSC 技术发展迅猛，但是该领域的临床研究才起步不久，iPSC 的临床应用仍受到以下几个方面的限制：（1）如何高效获得安全的、高纯度的iPSC；（2）如何定向诱导多能干细胞向某一特定类型的细胞分化并能在新的组织环境中承担成熟细胞的功能；（3）iPSC 在临床治疗上的有效性和安全性还需继续观察；（4）如何进一步制定临床应用上的标准和规范以及临床毒理和药理的分析方法和指标等。iPSC 技术仍然在不断发展，iPSC 的出现为“疾病特异性”和“病人特异性”的疗法带来了希望，期盼未来的研究能突破这一领域的临床瓶颈，早日迎来iPSC 的个性化医疗时代。