细胞自噬在膀胱癌发病、治疗中的作用研究进展

冯相鑫，夏成兴，王海峰，杨德林

(昆明医科大学第二附属医院，昆明 650101)

细胞自噬是一种高度进化保守的分解代谢活动，能够将受损老化细胞器包裹在特殊的膜结构中形成自噬体，并送入溶酶体降解。细胞自噬持续存在并遍及人体全身细胞。根据细胞受到代谢压力的大小，自噬可分为基础自噬和诱导自噬两种。健康状况下，自噬处于基础水平，对细胞的正常内环境起到监视作用；当细胞处于低氧、药物作用或射线等应激环境下，自噬水平将显著提高，分解代谢活动加强以适应细胞新的能量需求状态。自噬在细胞的动态平衡等过程中扮演重要角色。自噬异常与恶性肿瘤、帕金森病等神经退行性病变、克罗恩病等炎症性病变、肾小球硬化症及白内障等疾病的发生发展密切相关。细胞自噬有三种途径：①在没有自噬泡的形成的条件下，溶酶体直接内化并降解受损细胞器的过程称为微自噬；②分子伴侣先与靶蛋白结合，之后转运到溶酶体中降解的过程称为分子伴侣介导的自噬；③细胞内形成的错误蛋白或受损细胞器先被特殊的双层膜结构包裹之后再与溶酶体融合，进而将待降解底物送入溶酶体进行降解的过程称为巨自噬，降解后产生的的小分子物质又以合成新的蛋白质或产生能量的方式被机体利用。巨自噬是现阶段关于细胞自噬研究的焦点。在生理条件下，当细胞内产生错误折叠的蛋白质、活性氧和受损的线粒体时，适当水平的自噬能够发挥清除作用，避免因代谢应激增加引起的DNA损伤，进而提前抑制了肿瘤的发生。在肿瘤形成后，自噬能促进肿瘤细胞的存活，其主要机制是肿瘤细胞通过利用自噬产生的能量加强了在低氧和低营养状态下的生存能力。 自噬水平降低和自噬诱导在肿瘤的形成、发展阶段发挥重要作用。但目前对细胞自噬的认识还不够全面和成熟，精确检测细胞自噬的方法也正在探索和完善之中，研究方法差异及研究肿瘤对象的不同常常使得研究者们对自噬所扮演的角色得出不同的结论。现将细胞自噬在膀胱癌发病、治疗中的作用进展综述如下。

1 细胞自噬在膀胱癌发病中的作用

1.1 细胞自噬在膀胱癌细胞增殖中的作用 根据肿瘤所处微环境的不同，自噬发挥着抑制和促进的双重作用，在肿瘤发生的初始阶段自噬主要起抑制肿瘤发生的作用，在晚期则主要促进肿瘤的发展[1]。自噬基因Beclin1是一种重要的抑癌基因，Beclin1表观遗传学改变与肿瘤的发生发展密切相关[2]。研究[3]发现，乳腺癌、胃癌等癌细胞中存在Beclin1基因异常甲基化，同时伴有Beclin1 mRNA及蛋白质表达水平降低，进一步研究发现，在胸腺癌细胞系中过表达 Beclin1可抑制癌细胞的生长。 自噬是正常细胞的一种生理功能，对肿瘤的发生具有抑制作用。实体瘤组织中密集的癌细胞对氧气和营养物质需求更加迫切。应激状态下，肿瘤细胞可利用自噬降解产生物质和能量增强自身对抗苛刻内环境的能力，抑制癌细胞的凋亡[4]。 Beclin1是自噬体形成过程的一个必须分子，它能够介导其它参与自噬体形成的蛋白与吞噬泡结合，从而调控哺乳动物细胞中自噬体的生成和发展。 Beclin1在肿瘤从无到有的生成以及进一步的成熟过程中发挥重要作用，是一个重要的抑制癌症发生的基因[5]，一方面， Beclin1依赖于 Beclin1- PI3 KC3复合体促进吞噬泡的聚集与组装而参与自噬体的形成，另一方面， Beclin1与其他相关蛋白共同作用而调节自噬体的成熟。有学者[6]证明，Beclin 1在BTCC组织中表达下调，并且 Beclin 1高表达与患者5年生存率的提高相关。

Sivridis等[5]研究发现，高分级膀胱癌患者肿瘤组织中的自噬囊泡明显多于低分级患者，低分级患者肿瘤组织中的自噬囊又明显多于良性前列腺增生患者；高分级膀胱癌患者肿瘤组织自噬诱导标志物微管相关蛋白轻链3-Ⅰ(LC3-Ⅰ)向LC3-Ⅱ的转变水平明显高于低分级患者及良性前列腺增生患者。高、低分级膀胱癌患者的肿瘤组织中与自噬体初始形成阶段相关的关键蛋白Beclin-1 、Atg7相对表达量增加。当癌组织暴露于自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3 MA)中并处于同等的饥饿状态下，高分级膀胱癌肿瘤组织细胞凋亡数明显多于低分级膀胱癌组织，说明高分级膀胱癌组织自噬活性高。

Lin等[6]比较了人膀胱癌细胞系RT-4 、5637与膀胱上皮永生细胞SV-HUC-1的自噬活性后发现，与SV-HUC-1比较，RT-4 、5637细胞中自噬潮更活跃；进一步研究发现，自噬抑制剂Baf A1或自噬相关基因ATG-7、ATG-12的敲除可促进膀胱癌细胞的凋亡，说明自噬在膀胱癌细胞的生存、增殖中发挥积极作用。

1.2 自噬在膀胱癌细胞凋亡中的作用 正常生理状态下，小分子物质能够自由通过细胞的线粒体外膜，但凋亡等特殊状态刺激下，细胞线粒体外膜通透性增大，内膜和外膜间隙内与凋亡相关蛋白，如 CytC、核酸内切酶、凋亡抑制蛋白、 线粒体蛋白Smac/ DIABLO、凋亡诱导因子、 热休克蛋白60(Hsp60)、 Hsp10及核苷酸激酶等，可释放进入胞质， Cyt与 apaf-1结合并聚集成凋亡体，然后 procaspase-9被凋亡体募集后变成成熟的casepase-9。成熟的casepase-9进一步激活效应caspase-3，裂解PARP、活化核酸内切酶同时破坏细胞内的多种蛋白，最终导致细胞凋亡。Ojha等[7]在研究中发现，自噬抑制剂可导致膀胱癌细胞凋亡细胞数增多，为进一步探讨引起癌细胞死亡的机制，他们分别测量了不同处理后的普通尿路上皮细胞和膀胱癌细胞中 casepase-8、casepase-9活性，结果发现饥饿处理后的膀胱癌细胞casepase-9活性增加，自噬抑制剂Wm/3-MA处理对casepase-9的活性没有进一步的影响；单独饥饿处理后无法在膀胱癌细胞中检测到casepase-9活性，但加入自噬抑制剂后可检测到casepase-9活性升高。在外源性凋亡中， Procasepase-8与死亡诱导信号复合体(DISC)结合后， 经同源活化形成的 casepase-8，无论是在未经处理的还是经过饥饿处理或自噬抑制剂处理后的正常尿路上皮细胞和膀胱癌细胞中均未检测到；内源性凋亡以线粒体通透性和CytC释放入胞质为特征，他们还检测了不同处理下细胞膜电位的改变以及CytC的释放，得到的结果同样支持自噬抑制剂通过内源性凋亡引起癌细胞凋亡。以上研究均说明，细胞自噬水平增强可能通过抑制细胞内源性凋亡抑制膀胱癌细胞凋亡。

2 细胞自噬在膀胱癌治疗中的作用

非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)占初发膀胱肿瘤的70%，目前NMIBC 的治疗主要采用经尿道膀胱癌电切术( TUR-BT) 配合术后膀胱灌注化疗，TUR-BT既是NMIBC的重要诊断方法，同时也是主要的治疗手段，膀胱灌注的目的是防止肿瘤复发、延缓疾病进展。目前膀胱癌的复发率很高，10%～30%的膀胱癌患者可能进展为浸润性膀胱癌(MIBC)[9]。过去20年内，MIBC的五年生存率基本没有变化。新辅助铂类化疗(NAC)在膀胱癌根治术前的应用提高了非转移性 MIBC患者7%的五年生存率[10]，但目前膀胱癌的病死率没有发生很大的改变。因此，新治疗方法的产生或现有治疗方法有效率的提高将有利于膀胱癌患者的治疗结果。近年来，自噬抑制剂作为辅助药物联合化学疗法治疗尿路上皮癌得到了进一步的研究和认可，但膀胱癌细胞在治疗过程中容易发生耐药，严重影响患者预后。最新研究[11]表明，膀胱上皮癌干细胞暴露于吉西他滨和丝裂霉素中培养后，细胞自噬活性升高、糖酵解基因高表达、抑制自噬导致糖酵解基因表达降低，干细胞基因及耐药基因的表达均降低，细胞凋亡数增加。这项研究表明，自噬与糖酵解可能在细胞耐药性中发挥核心作用。

目前膀胱灌注的常用化疗药物有表柔比星、吡柔比星、丝裂霉素、阿霉素、羟基喜树碱等。对于高危NMIBC，免疫增强剂BCG可通过诱导局部免疫反应预防膀胱肿瘤的复发和进展。临床上，吉西他滨联合顺铂治疗晚期膀胱癌已经成为膀胱癌治疗的新标准。牛文杰等[12]的临床研究证实这种新辅助化疗能够使浸润性肿瘤直径减小、分期降低。其安全性和耐受性较传统的M-VAC方案更胜一筹。

在肿瘤的发生发展中，增强的自噬水平既可为肿瘤细胞提供生存营养和转移条件，也可诱导肿瘤细胞的凋亡。近年的研究将BCG通过诱导机体局部免疫反应预防膀胱癌复发和进展的非特异性作用称为训练免疫，而细胞自噬是这种训练免疫信号诱导通路的主要参与者之一[13]。Huang等[14，15]通过实验得出结论，吉西他滨(GEM)在诱导人膀胱癌 T24细胞凋亡的同时还提高细胞自噬，抑制其自噬后 T24细胞对 GEM的化疗敏感性即凋亡增加，顺铂诱导的膀胱癌细胞 T24自噬能够促进其诱导的细胞凋亡过程，证明顺铂诱导的自噬对膀胱癌的治疗起积极作用，这也进一步解释了新辅助化疗吉西他滨+顺铂方案有效性的可能原因。最新研究[16]表明，传统抗疟药氯喹能抑制膀胱癌 EJ和 T24细胞被辐射诱导的自噬，从而增加细胞的凋亡。

姜黄素(Cur)是从姜黄的根茎中提取的一种天然化合物，具有抗多种肿瘤的作用[17, 18]。Cur 还能够增加吉西他滨等传统化疗药物的疗效。Cur能够诱导 T24 细胞发生自噬，试验[19]发现用3-MA 联合 Cur预处理的T24细胞凋亡率显著低于Cur单独处理者，说明Cur诱导的细胞自噬与其凋亡诱导效应有关。Kang等[20]通过人膀胱癌细胞T24和J82的体外实验发现：阿伐他汀可通过促进癌细胞凋亡和诱导细胞自噬水平增加，进一步降低T24、J82的细胞活性。自噬抑制剂可协同促进阿伐他汀的促膀胱癌细胞凋亡作用。

桧木醇是一种从柏科植物中提取的天然化合物，Gao等[21]通过实验发现，自噬抑制剂3- MA可部分逆转桧木醇对肿瘤细胞的作用，并通过比较桧木醇和3- MA联合给药及桧木醇单独作用时 LC3-Ⅱ的表达量得出结论，桧木醇激活的不适当的细胞自噬引起了膀胱癌J82细胞的凋亡。用葡萄籽提取物(GSE)处理膀胱癌T24和 HTB9细胞后，不仅癌细胞的生长出现抑制现象，而且细胞死亡数量增大[1]。研究者观查到GSE处理后的癌细胞中出现胞质空泡。进一步分析证明这些胞质空泡为自噬囊泡。他们在处理癌细胞的同时加入了自噬抑制剂后，癌细胞凋亡明显增加，证明GSE诱导的自噬起到抑制癌细胞凋亡的作用。而上述观察到的凋亡和自噬现象均由GSE介导的氧化应激所触发[22]。淫羊藿素是一种从淫羊藿属植物中分离得到的黄酮醇苷，体外实验发现尽管淫羊藿素对正常人胚肾293细胞的细胞毒性比较低，但它能明显抑制人膀胱癌细胞BT5673和T24的增殖和聚集，通过线粒体膜电位的检测发现细胞活性也被明显抑制。进一步的研究发现，当淫羊藿素和表柔比星(EPI)联合使用时，淫羊藿素通过抑制EPI诱导的细胞自噬，增强了EPI对BT5673和T24细胞增殖的抑制效应[23]。

紫檀芪是首先在紫檀种植物中发现的一种化学成分，对于多种癌症、高血脂、高血压都有一定的治疗效果。研究[24]发现紫檀芪能够通过引起细胞周期阻滞、诱导自噬和凋亡有效抑制敏感和耐药人膀胱癌细胞的生长。粉防己碱(Tet)提取自植物粉防己的根块，已有研究表明 Tet可逆转肿瘤细胞耐药，增加肿瘤治疗敏感性[25， 26]。Ni 等[27]通过实验发现用Tet 处理过的膀胱癌 T24 细胞内自噬泡的数量明显增多，进一步通过LC3 反转实验发现Tet 通过阻断自噬流下游引起自噬泡增多。

综上所述，细胞自噬已成为潜在的攻克多种疾病的研究热点之一。Beclin1的异常表达(甲基化、过表达)可抑制膀胱癌细胞的增殖，细胞自噬水平增加可能通过抑制细胞内源性凋亡抑制膀胱癌细胞凋亡。姜黄素、桧木醇、葡萄籽提取物、淫羊藿素、紫檀芪、粉防己碱等化合物均可通过抑制细胞自噬水平，进一步促进膀胱癌细胞的凋亡。