HIF-3α对肝细胞癌多药耐药的影响及其机制

占静，何晓晓，邱梦君，孙飞，魏柏

(华中科技大学同济医学院附属梨园医院，武汉430077)

肝细胞癌是原发性肝癌最常见的组织学类型，是世界上第五大常见恶性肿瘤，在恶性肿瘤相关死亡原因中居第三位[1]。肝细胞癌起病隐匿，多数患者就诊时已进展至中晚期，错过了最佳手术时机[2]。因此，多学科综合治疗成为目前国内外肝细胞癌治疗的主要模式。化疗在肝细胞癌综合治疗中占有重要地位。但肝细胞癌多药耐药导致常规化疗效果并不理想[3]。肿瘤化疗多药耐药产生的原因十分复杂，与多药耐药基因1(MDR1)、多药耐药相关蛋白2(MRP2)、肺耐药蛋白(LRP)、谷胱甘肽硫转移酶pi(GST-pi)、拓扑异构酶Ⅱα(TopoⅡα)等有关[4]。缺氧是实体瘤中普遍存在的现象，而肿瘤细胞在缺氧状态下对化疗药物不敏感。因此，缺氧可能是导致肿瘤化疗多药耐药的重要原因[4,5]。缺氧诱导因子(HIF)是一类介导细胞适应低氧状态所必需的转录激活因子，由α、β亚基组成。在多种肿瘤中，HIF表达增加能激活许多靶基因转录，从而引起细胞代谢重编程、细胞增殖和凋亡以及耐药性改变等。目前发现的HIF α亚基有3种异构体，分别为HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α[6]。研究证实，HIF-1α、HIF-2α可促进肿瘤化疗多药耐药产生[7～9]。而HIF-3α与肿瘤化疗多药耐药的关系目前尚不清楚。2017年9月～2018年6月，本研究观察了HIF-3α对肝细胞癌多药耐药的影响，并探讨其可能的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞株HepG2(以下称HepG2细胞)，购自中国典型培养物保藏中心。HIF-3ɑ基因靶序列及其相关引物序列，由武汉谷歌生物科技有限公司设计合成。2720热循环PCR仪，美国Applied Biosystems公司；凝胶图像分析系统，上海天能科技有限公司；荧光显微镜，日本奥林巴斯公司。感受态大肠杆菌DH5α、免疫组化SP试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒，武汉谷歌生物科技有限公司。TRIzol、Power SYBR®Green PCR Master Mix，美国Life Technologies公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit，上海捷瑞生物工程有限公司；质粒DNA抽提试剂盒，北京天根生化科技有限公司；包装质粒载体GV287(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-gcGFP)及辅助包装质粒pHelper1.0、pHelp-er2.0，上海吉凯基因化学技术有限公司。HIF-3α抗体，英国Abcam公司；MDR1、β-actin抗体，美国Santa Cruz Biotechnology公司；MRP2、LRP、GST-pi、TopoⅡα抗体，美国Proteintech Group公司。

1.2 HIF-3α过表达慢病毒构建 参照GeneBank中HIF-3α(NM_152795.2)基因编码序列，设计合成HIF-3α基因片段。在BamHI/AgeI酶切位点对GV287载体进行双酶切，然后进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分离纯化。分离纯化产物与GV287载体酶切后产物用T4 DNA连接酶连接。将连接产物转染至感受态大肠杆菌DH5α，使用嘌呤霉素筛选培养。挑选阳性克隆进行酶切和测序，并与目的基因序列进行比对。

1.3 慢病毒包装与滴度测定 ①慢病毒包装：将上述构建的重组GV287-HIF-3α慢病毒质粒与辅助包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0，按5∶3∶2共转染293T细胞，转染6 h更换培养液，继续转染48 h。收集培养液上清液，经0.45 μm滤器过滤，4 ℃、25 000 r/min离心2 h，用DMEM培养基重悬细胞沉淀，充分溶解后10 000 r/min离心5 min，留取上清，-80 ℃保存。②慢病毒滴度测定：取对数生长期、生长状态良好的293T细胞，接种于96孔板，每孔4×104个；根据慢病毒预期滴度，准备7～10个无菌EP管，每管加入90 μL无血清培养基；取待测慢病毒原液10 μL加入第1个EP管中，充分混匀，取10 μL再加入第2个EP管中，依此类推，直至最后1个EP管。将稀释好的病毒溶液加入96孔板，继续培养72 h，观察荧光标记的慢病毒表达情况，统计绿色荧光蛋白标记细胞数目，计算慢病毒滴度。慢病毒滴度=绿色荧光蛋白标记细胞数目/慢病毒原液量。

1.4 HIF-3α过表达对HepG2细胞多药耐药相关基因表达的影响

1.4.1 HIF-3α过表达的HepG2细胞构建 ①细胞传代培养：将HepG2细胞接种于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养；当细胞融合70%～80%时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶4传代。②细胞转染：取传2代、对数生长期、生长状态良好的HepG2细胞，接种于6孔板，每孔1×105个。随机将细胞分为HIF-3α组、阴性对照组、空白对照组，每组设2个复孔。HIF-3α组按10 MOI加入HIF-3α过表达慢病毒和含聚凝胺的培养基，阴性对照组按10 MOI加入GV287空载体和含聚凝胺的培养基，空白对照组仅加入等量培养基。转染12 h，吸弃含聚凝胺的上清液，加入新鲜含5%嘌呤霉素的培养基继续培养60 h。③转染效率验证：采用real-time PCR法。收集各组细胞，TRIzol法提取细胞总RNA，按PrimeScriptTMRT Reagent Kit说明将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，按Power SYBR®Green PCR Master Mix说明进行PCR扩增。引物序列：HIF-3α上游引物5′-GGGAGAACCACTGGATGCCT-3′，下游引物5′-AGAAACTAAAGTAGGTGGGGA-3′；β-actin上游引物5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTGAC-3′，下游引物5′-GCTCGCTCCAACCGACTGC-3′。按试剂盒说明配制反应体系。反应条件：95 ℃ 30 s， 95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s共40个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.4.2 HIF-3α过表达对HepG2细胞MDR1、MRP2、LRP、GST-pi、TopoⅡα mRNA表达的影响 采用real-time PCR法。收集各组细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA，按PrimeScriptTMRT Reagent Kit说明将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，按Power SYBR®Green PCR Master Mix说明进行PCR扩增。引物序列：MDR1上游引物5′-ATATCAGCAGCCCACATCAT-3′，下游引物5′-GAAGCACTGGGATGTCCGGT-3′；MRP2上游引物5′-ACGGACAGCTATCATGGCTTCT-3′，下游引物5′-TGGTCACACCATGAGCTTCT-3′；LRP上游引物5′-GTCTTCGGGCCTGAGCTGGTGTCG-3′，下游引物5′-CTTGGCCGTCTCTTGGGGGTCCTT-3′；GST-pi上游引物5′-ACCCCAGGGCTCTATGGGAA-3′，下游引物5′-TGAGGGCACAAGAAGCCCCT-3′；TopoⅡα上游引物5′-TGACAGTGAAGAAGACAGC-3′，下游引物5′-GAGAGACACCAGAATTCAA-3′；β-actin上游引物5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTGAC-3′，下游引物5′-GCTCGCTCCAACCGACTGC-3′。按试剂盒说明配制反应体系。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s共40个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.5 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。计量资料以平均数表示，结果比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-3α过表达慢病毒构建结果 人HIF-3α全长53 386 bp，琼脂糖凝胶电泳显示片段大小如预期。挑取阳性克隆测序，结果与GenBank中HIF-3α序列完全一致。

2.2 慢病毒包装及其滴度 培养72 h，荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光，证明慢病毒包装成功。经计算，慢病毒滴度为1.0×108TU/mL。

2.3 各组HIF-3α表达比较 空白对照组、阴性对照组、HIF-3α组HIF-3α mRNA相对表达量分别为1、1.08、2 100。HIF-3α组HIF-3α mRNA相对表达量明显高于阴性对照组和空白对照组(P均<0.05)，而阴性对照组与空白对照组比较P>0.05。

2.4 各组MDR1、MRP2、LRP、GST-pi、TopoⅡα mRNA表达比较 空白对照组、阴性对照组、HIF-3α组MDR1 mRNA相对表达量分别为1.00、1.08、0.97，MRP2 mRNA相对表达量分别为1.00、1.08、1.00，LRP mRNA相对表达量分别为1.00、1.08、1.61，GST-pi mRNA相对表达量分别为1.00、1.08、1.20，TopoⅡα mRNA相对表达量分别为1.00、1.08、0.87。与空白对照组和阴性对照组比较，HIF-3α组GST-pi、LRP mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05)，其余多药耐药基因相对表达量组间两两比较P均>0.05。

3 讨论

原发性肝癌是严重威胁人类健康的重大疾病之一，具有流行性广、病程短、病死率高等特点[10，11]。目前，原发性肝癌的治疗方法有外科手术、放疗、化疗等。由于多数患者就诊时已属中晚期，错过了根治性手术最佳时机，药物治疗成为其主要治疗手段。但药物治疗，即使是新型的靶向药物，仍然无法避免治疗数月后出现的耐药问题，特别多药耐药，已成为影响肿瘤药物治疗效果的最大障碍[4]。肿瘤多药耐药的机制尚不完全清楚，已知涉及多药耐药的基因主要包括：①以细胞膜上能量依赖式外排泵介导的MDR，如MDR1、MRP；②以细胞质中酶介导的MDR，如GSTs；③以细胞核核孔蛋白介导的MDR，如LRP；④以细胞核内酶介导的MDR，如TopoⅡ[4]。这些MDR参与肿瘤多药耐药过程，是目前监测肿瘤多药耐药的重要标志物。

缺氧是实质性肿瘤微环境的基本特征之一。缺氧环境不仅能促进肿瘤细胞增殖、迁移和血管生成，还能抑制肿瘤细胞分化、凋亡。近年研究发现，缺氧环境与肿瘤的多药耐药密切相关[12]。HIF是一种可上调包括血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶、糖酵解酶等靶基因表达的核转录因子，是缺氧应答反应时最重要的调节因子之一[12]。HIF可能是实体瘤发生、发展及多药耐药的关键因子之一。HIF包括HIF-α和HIF-β。HIF-3α作为HIF-α家族的一员，其结构与HIF-1α、HIF-2α具有高度相似性。有研究指出，HIF-3α与HIF-1α、HIF-2α具有协同作用。Tanaka等[13]研究发现，HIF-1α和HIF-3α在细胞中定位一致，在siRNA介导的人肾细胞癌中，敲低HIF-1α亦能明显下调HIF-3α。Pasanen等[14]研究证实，HIF-3α在缺氧期间可诱导HIF-1α表达。Hatanaka等[15]研究发现，HIF-3α的启动子活性能被HIF-2α特异性激活。HIF-2α能特异性结合mHIF-3α启动子中-251和-228之间的序列，这对HIF-2α的激活是必需的。在人脐静脉内皮细胞中，HIF-3α表达由HIF-1α和HIF-2α共驱动[16]。Warfel等[17]研究发现，敲低肿瘤细胞HIF-1α表达能明显降低缺氧诱导的MDR1表达。朱虹等[18]研究发现，随着缺氧时间延长，HepG2细胞中多药耐药相关基因MDR1、MRP1、LRP表达逐渐升高，而且这些多药耐药相关基因表达升高与HIF-1α表达呈同步化改变。Yuan等[19]研究显示，HIF-2α亦可诱导肝癌5-氟尿嘧啶耐药细胞中多药耐药基因表达。有研究还发现，HIF-2α能通过干性通路引起肝癌MDR[20]。以上研究表明，HIF-1α、HIF-2α均为促进肿瘤多药耐药的关键分子。而HIF-3α的结构与HIF-1α、HIF-2α具有高度相似性，因此推测HIF-3α也可能是肿瘤多药耐药的关键分子。

本研究成功构建了HIF-3α过表达慢病毒，其测序结果与GeneBank中HIF-3α的基因编码序列完全一致。该基因编码序列慢病毒包装后，荧光显微镜下可见大量绿色荧光，说明慢病毒包装成功，经计算，慢病毒滴度为1.0×108TU/mL。用HIF-3α慢病毒转染HepG2细胞，结果发现，HIF-3α组HIF-3α mRNA相对表达量明显高于阴性对照组和空白对照组，而阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义，证实该慢病毒成功转染入HepG2细胞。进一步研究发现，HIF-3α组GST-pi、LRP mRNA相对表达量均明显高于空白对照组和阴性对照组，而MDR1、MRP2、TopoⅡα mRNA相对表达量组间两两比较差异均无统计学意义。结果表明，HIF-3α通过激活药物穿胞过程中LRP及细胞解毒过程中GST-pi的表达，促进肝细胞癌多药耐药发生。

综上所述，HIF-3α可能与肝细胞癌多药耐药有关，其机制与上调多药耐药相关基因GST-pi、LRP表达有关。