细胞应激对外泌体功能影响的研究进展

刘朝阳，李文博，王炜，胡雅茹，任伟宏

(1河南中医药大学，郑州 450000；2河南中医药大学第一附属医院)

外泌体是细胞内多囊泡体与细胞膜融合释放到细胞外环境的直径30～150 nm的囊泡，外泌体由脂质、核酸(mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA)和蛋白质(受体，转录因子，酶)组成[1,2]。细胞通过外泌体将脂质、核酸或蛋白质转移至受体细胞中，介导细胞间通信，调节细胞的生理和病理状态，如炎症、免疫反应、血管生成、细胞死亡、神经退行性疾病和癌症等[3]。细胞应激是指在细胞受到各种理化代谢或生物性损伤因素时，产生一系列适应性的代偿反应，以增强细胞的抗损伤能力和生存能力。现已发现，细胞能够通过外泌体来对应激做出反应，即不同的应激因素会影响细胞分泌的外泌体的丰度、组成以及功能，以此来调节细胞间的信息交流[4]。对外泌体介导的细胞应激反应的深入研究，有助于人们阐明疾病的发病机制以及疾病治疗的疗效。现就细胞应激(包括热应激、氧化应激、低氧应激、基因毒应激、营养应激)对外泌体功能的影响进行综述。

1 热应激对外泌体功能的影响

热是最常见的应激因素之一，蛋白质会因温度升高而变性，进而失去活性和丧失功能，因此热应激是细胞应激中典型的蛋白毒性类型。蛋白质功能发生变化会干扰细胞内部的稳态，产生热休克反应(HSR)。HSR的主要效应物是热休克蛋白(HSP)，HSP能帮助蛋白质恢复正常的生理功能，维持细胞的稳态。研究表明，不论外泌体来源如何，其内部均广泛存在着HSP70和HSP90[5]。Cho等[6]发现热应激(43 ℃，30 min)处理后的小鼠结肠癌细胞分泌的外泌体中HSP70的含量较未经处理的细胞高，同时，热应激处理后产生的外泌体能够激活树突状细胞和巨噬细胞，触发协同免疫反应，并能增强辅助性T细胞1(Th1)型免疫应答，清除肿瘤细胞。Zhong等[7]发现，热应激(42.8 ℃，4 h)能够使胃癌患者的恶性腹水中外泌体的HSP70和HSP60含量升高，这些外泌体可以促进树突状细胞的成熟并提高细胞毒性T淋巴细胞的抗肿瘤活性。热应激后的细胞释放的外泌体能够介导无应激细胞的旁观者效应，与正常细胞释放的外泌体相比，45 ℃处理1 h后的细胞释放的外泌体能够降低受体细胞的活性，并增加受体细胞中DNA损伤和细胞凋亡的水平，另一方面，热应激后生成的外泌体也可以增强受体细胞的抗热激能力，显示出热应激生成的外泌体的双面作用[8]。Guo等[9]发现，在热应激的巨噬细胞生成的外泌体中含有大量的HSP70，通过HSP70诱导的IL-6将调节性T细胞转化为Th17细胞，产生抗肿瘤的作用。也有人研究了细胞在热应激作用下产生的外泌体中的RNA变化。Chen等[10]发现热应激的血管内皮细胞产生的外泌体中存在着多种上调的miRNA，这些上调的miRNA的靶向基因主要是细胞凋亡相关的基因，外泌体中还有10个上调和10个下调的lncRNA，但它们的功能尚未研究清楚，不过外泌体中的这些RNA的变化可以作为中暑诊断的非入侵性生物标志物。

2 氧化应激对外泌体功能的影响

氧化应激是指机体内活性氧(ROS)的异常增多，抗氧化剂无法清除过多的ROS，ROS与抗氧化剂防御系统失衡，导致细胞的正常生理功能受到不同程度的影响。ROS对细胞的影响取决于ROS的浓度和种类，例如，低浓度的ROS可刺激细胞增殖，而高浓度的ROS会导致细胞周期停滞甚至凋亡或死亡。研究发现，外泌体似乎可以帮助人们更好的解释ROS对细胞的作用机制。Saeed-Zidane等[11]将牛颗粒细胞与H2O2共孵育生成的外泌体与正常细胞生成的外泌体中的mRNA对比后发现，核因子E2相关因子2(Nrf2)、过氧化氢酶(CAT)和硫氧还蛋白1(TXN1)的mRNA在共孵育后的外泌体中含量更高，细胞摄取这种外泌体后，Nrf2及其选择性下游抗氧化剂(CAT和TXN1)的mRNA水平显著增加，并且Nrf2和CAT1基因的蛋白质表达也显著增加，这些物质增强了细胞的抗氧化能力，使细胞免受不利环境产生的氧化应激的损伤。Sheller等[12]通过蛋白质谱分析发现，人羊膜上皮细胞在香烟烟雾提取物诱导的氧化应激的作用下产生的外泌体比正常细胞的外泌体含有48种独有的蛋白质，与细胞外调节蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、上皮黏附连接信号传导途径和嗜酸性炎症相关的蛋白质含量偏高，通过蛋白质免疫印迹分析还发现，来自应激细胞的外泌体中也含有较高含量的p38 MAPK，这表明外泌体可以反映亲代细胞的生理状态，并且可以用于监测妊娠情况。Biasutto等[13]发现，在氧化应激作用下的人视网膜上皮细胞分泌的外泌体与正常细胞分泌的外泌体相比，外泌体所含的蛋白质的含量和种类发生了变化，氧化应激产生的外泌体中的蛋白质与细胞死亡、细胞增殖以及新陈代谢有关，外泌体中蛋白质的变化说明外泌体在视网膜氧化应激相关疾病中具有潜在的诊断价值。

3 低氧应激对外泌体功能的影响

氧对维持机体生命活动十分重要，在细胞处于低氧状态时，细胞将通过激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)激酶和低氧诱导因子(HIF)相关的途径，停止细胞周期以减少能量消耗。现已发现，外泌体可能是细胞在低氧条件下的细胞间通信的主要参与者，而且对缺氧的反应远远高于细胞水平。Kore等[14]发现，低氧(0.5% O2)条件培养的胶质母细胞瘤分泌的外泌体中关于血管生成和细胞外基质重塑的蛋白质含量显著增加，如蛋白赖氨酸-6-氧化酶(LOX)、血小板反应蛋白-1(TSP1)、血管内皮因子(VEGF)等，同时，低氧时细胞分泌的外泌体能够诱导血管生成和增强细胞的活力。Cosme等[15]分析了小鼠心脏成纤维细胞在正常(21% O2)和低氧(2% O2)两种条件下释放的外泌体的蛋白质组，分别鉴定出1 752和1 616种蛋白质，定量分析显示在缺氧条件下释放的外泌体中有144种蛋白质的表达存在显著差异(71种蛋白质显示上调，另73种蛋白质显示下调)，而且在缺氧条件下释放的外泌体中富含的蛋白质主要与线粒体有关，表明外泌体具有维持因缺氧而受损的线粒体功能的作用。Ramteke等[16]研究发现，前列腺癌细胞在低氧(1% O2)时产生的外泌体与正常时产生的外泌体相比直径变小，且含有的蛋白质种类更多，同时低氧时产生的外泌体显示出更高的金属蛋白酶活性，并能诱导微环境的变化，增强前列腺癌细胞的侵袭性。Yu等[17]研究了低氧应激对肝癌细胞外泌体中RNA的影响，发现低氧不仅会使外泌体的产量增加，而且外泌体中miRNA-1273f的含量也较高，外泌体在低氧时通过转运miRNA-1273f来增强肿瘤细胞的增殖、迁移和转移的能力。Qian等[18]同样分析了低氧应激对细胞外泌体中RNA的影响，在低氧应激的胶质瘤细胞释放的外泌体所含的RNA中,miRNA-1246的含量最高，miRNA-1246能够激活信号转导及转录激活因子(STAT)信号通路并抑制核因子激活的B细胞的κ-轻链增强(NF-κB)信号通路，诱导M2巨噬细胞的极化。

4 基因毒应激对外泌体功能的影响

细胞内遗传物质的稳定与细胞稳态的维持密切相关，在电离辐射(IR)或紫外线辐射、烷化剂、ROS以及拓扑异构酶和解螺旋酶的抑制剂等的作用下，DNA会产生不同程度的损伤，而细胞可通过复杂的分子机制来修复DNA以维持基因组的稳定，DNA损伤后的调控包括细胞周期检查点、DNA修复以及是否在DNA无法修复时激活细胞程序性死亡[19]。研究发现，基因毒应激会影响细胞外泌体的释放及组成。Jelonek等[20]分析了人咽鳞癌细胞在IR作用下分泌的外泌体中的蛋白质组分，发现IR后的细胞分泌的外泌体存在236种特异性蛋白质，且外泌体中含有过量表达的参与细胞转录和翻译、细胞分裂和细胞信号转导相关的蛋白质。Abramowicz等[21]用IR处理头颈部鳞癌细胞后，发现外泌体中有472种蛋白质的丰度受到IR的显著影响，其中包括425种上调的蛋白质和47种下调的蛋白质，这些蛋白质主要与细胞中的ROS代谢、DNA修复、染色质包装和蛋白质折叠有关，反映了外泌体在细胞基因毒应激时发挥的作用。有人比较了IR后的神经胶质瘤细胞释放的外泌体与正常培养的细胞释放的外泌体中的蛋白质组，发现IR导致外泌体中的蛋白质的种类减少了将近700种，剩余的蛋白质直接或间接的参与细胞对IR的应激反应，如蛋白酶体途径、Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)-STAT信号途径和细胞周期调控，而且IR作用后细胞释放的外泌体能在体外增强受体细胞的增殖能力和抗辐射能力[22]。Yentrapalli等[23]用全血样本进行的实验表明，受到辐射的血细胞分泌的外泌体具有调节免疫的能力，在这些外泌体中，关于急性期反映信号传导、补体系统、IL-12信号传导和巨噬细胞功能调节的蛋白质的丰度显著增加。也有人报道了其他导致细胞基因毒应激的因素，如顺铂处理的卵巢癌细胞释放的外泌体的直径显著小于正常细胞释放的外泌体，而且顺铂处理的细胞释放的外泌体能够增强其他肿瘤细胞的侵袭性并能引起周围细胞的旁观者效应和对顺铂的抗性[24]。还有人分析了使用烷化剂替莫唑胺治疗多行性胶质母细胞瘤患者的外周血中的外泌体，与正常人相比，GSC患者的外周血中的外泌体含量更高，而且外泌体与细胞黏附相关的蛋白质的含量也显著增加，使肿瘤细胞更容易转移和复发，最终导致临床治疗的失败[25]。

5 营养应激对外泌体功能的影响

营养物质对于细胞正常生理功能和稳态的维持至关重要，葡萄糖对细胞是最重要的营养物，葡萄糖的不足和过量均会引起细胞应激。最近研究表明，外泌体也可能在葡萄糖相关疾病中发挥作用。Garcia等[26]发现大鼠心肌细胞H9C2细胞系以及大鼠原代培养的心肌细胞在低糖的情况下，外泌体的合成和分泌量会增加，低糖时产生的外泌体能将功能性葡萄糖转运蛋白和糖酵解酶传递给内皮细胞，使内皮细胞的葡萄糖摄取能力、糖酵解活性和丙酮酸产生增加。也有学者研究了高糖应激下细胞分泌的外泌体的成分和功能的变化。Saez等[27]发现在高糖环境下培养的人脐静脉血管内皮细胞释放的外泌体的量会增加，并且通过增强内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、人类阳离子型氨基酸转运蛋白1型(hCAT-1)、VEGF和细胞内黏附分子1型(ICAM-1)蛋白的表达来增强内皮细胞伤口愈合的能力。另外，有学者发现高糖环境会增加肾小管内皮细胞外泌体的释放量，同时导致足细胞的上皮—间质转化和屏障功能障碍[28]。Ling等[29]发现高糖能增加肾小管内皮细胞释放出富含circRNA的外泌体量，测序后显示，这些外泌体中有217个circRNA的表达显著下调和484个circRNA的表达显著上调，高糖应激的肾小管上皮细胞释放的外泌体能够促进肾小管上皮细胞α-平滑肌肌动蛋白的表达，抑制肾小球系膜细胞的增殖并促进上皮—间质转化。

6 结论

虽然现有的数据还远远不够完善，但已经说明了外泌体在细胞应激反应中发挥着重要作用。现已发现，细胞应激时释放的外泌体中的内容物发生了明显的变化，但目前的研究还未找出细胞应激状态下外泌体中共有的标志物。另外，在用相似的应激条件处理细胞所释放的外泌体中的内容物也不尽相同，这种差异反映了不同的生物学模型(细胞类型和应激条件)以及所分析的外泌体的特定类型。尽管如此，在不同的生物学模型中的不同的外泌体，却具有相似的生物学功能，对受体细胞产生相似的作用。现有的数据表明，在细胞应激时释放的外泌体可能参与调节细胞的增殖和迁移，影响细胞的活力，改变细胞外环境以及血管生成等。解释外泌体在介导细胞应激中的作用和机制，以及外泌体在细胞间通信中的作用和机制，仍需进一步的研究。