基因工程小鼠胃癌模型的研究进展*

黄可婷 金多晨 党旖旎 张国新

南京医科大学第一附属医院消化科(210029)

胃癌是全球第二大肿瘤相关死亡原因，5年生存率小于25%[1]。动物模型能模拟体内胃癌发生、转化、侵袭等一系列生物学特性，是研究胃癌及其潜在机制的重要工具。近年来，随着基因工程和分子生物学技术的发展，基因工程小鼠模型的运用越来越广泛。这种小鼠模型往往用于探究特定基因型与疾病表型的关联，极大地丰富了对宿主基因功能和疾病遗传特征的理解。本文就常见的基因工程小鼠胃癌模型作一综述。

一、胰岛素-胃泌素(insulin-gastrin, INS-GAS)小鼠

INS-GAS小鼠是应用最为广泛的肠型胃癌模型，其转基因序列由人胃泌素编码序列上游的胰岛素启动子组成。小鼠早期表现为高胃泌素血症、胃萎缩，随后向肠化生和异型增生发展，20月龄时75%发生胃体侵袭性肿瘤[2]。幽门螺杆菌(Hp)是INS-GAS小鼠的Ⅰ类致癌物，Hp感染后小鼠肠化生明显加快，且易发生黏膜内浸润和血管浸润[2]。由于致癌阈值低，重现性好，Hp感染的INS-GAS小鼠是较为理想的胃体肿瘤模型。

目前，这种小鼠模型主要用于研究胃癌的发病机制、干预治疗、菌群共生等。Hp感染促进小鼠体内胃泌素表达，进而诱导胃上皮细胞尤其是壁细胞凋亡[3]。同时，Hp感染可抑制小鼠核苷酸结合寡聚化结构域1(nucleotide-binding oligomerization domain containing 1, Nod1)受体表达，改变巨噬细胞的极化状态，加重损伤反应[4]。作为药物治疗模型，INS-GAS小鼠已获得良好的应用。有研究[5]将雌二醇联合他莫昔芬治疗小鼠胃癌，证实了雌激素信号转导在胃癌中的作用。经化疗药物吉非替尼干预后，INS-GAS小鼠体内表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)受到抑制，提示吉非替尼对胃癌有潜在的治疗效应[6]。此外，对不同感染状态下INS-GAS小鼠的研究[3]发现，肠道细菌协同Hp感染可诱导胃癌的发生。三种肠道细菌(包括ASF356梭菌属、ASF361乳杆菌属和ASF519拟杆菌属混合物)促进INS-GAS小鼠胃部病变，Hp感染可加速病变进展[7]。最近一项评估Hp感染后小鼠胃黏膜谱系变化的研究[8]结果表明，Hp主要启动胃中解痉多肽表达型化生(spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia, SPEM)，进一步肠道细菌感染可促进凹陷性增生、肠化生和血管侵袭。上述研究结果提示，Hp诱导INS-GAS小鼠发生胃癌需要额外细菌的作用，肠道细菌定植可能是胃癌发生的另一重要原因。

二、TFF1基因敲除(TFF1-/-)小鼠

TFF1(又称pS2)属三叶肽家族成员，具有黏膜保护和修复的作用。TFF1-/-小鼠最早由Lefebvre等[9]通过同源重组技术进行构建，所有小鼠均发展为胃窦和幽门腺瘤，30%发展为多灶性上皮内癌或黏膜内癌。Hp与TFF1沉默表达具有协同作用，Hp感染后TFF1-/-小鼠胃腺癌的发生率显著增加[10]。体外实验表明，TFF1能与Hp相互作用特异性结合人胃黏蛋白，促进细菌在胃黏液层中的定植[11]。该现象解释了细菌对胃组织的趋向性，但尚缺乏体内证据，需进一步研究来阐明两者之间的关系。

TFF1-/-小鼠模型常用于免疫细胞浸润、信号转导失调和上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等促癌机制的研究。与野生型小鼠相比，TFF1-/-小鼠胃窦组织中存在大量T细胞和巨噬细胞，TFF1沉默是胃内免疫细胞浸润的关键步骤[12]。研究表明，多种信号通路通过介导TFF1参与胃癌的发生。TFF1基因沉默可激活肿瘤坏死因子α/IκB激酶(TNF-α/IKK)途径，促进NF-κB介导的炎症反应[13]。通过调节AKT-GSK-3β轴，TFF1沉默促进β-连环蛋白活化，进而诱导肿瘤的形成[14]。在炎-癌转化过程中，EMT与TFF1表达相关。胃损伤诱导TFF1表达上调，最终触发EMT参与黏膜损伤的修复[15]。TFF1在炎症中表达增高而在肿瘤中表达沉默。最近一项检测胃黏膜变化的研究[16]发现，Hp急性感染期(<2周)TFF1表达上调以抑制炎症；当感染持续存在时，TFF1表达下降直至沉默。发生其他消化系统肿瘤(如胰腺肿瘤)时，TFF1-/-小鼠亦可检测出EMT表型[17]。然而，胃癌中TFF1与EMT之间的关联尚未见报道。

三、Gp130敲入突变(gp130757F/F)小鼠

Gp130757F/F小鼠由敲入点突变产生，该突变将细胞内gp130 757位置上酪氨酸残基(Y)转化为苯丙氨酸残基(F)，可阻断SHP-2/Ras/ERK信号转导[18]。Gp130757F/F小鼠体内TFF1表达缺失，病理表现与TFF1-/-小鼠类似，3个月时进展为胃腺瘤，成瘤率100%[19]。Gp130受体主要触发下游三种信号途径，即JAK/STAT、SHP-2/ERK/MAPK和Src/PI3K/AKT。Hp通过细胞毒素相关蛋白(cytotoxin-associated gene A protein, CagA)影响不同通路的活性，磷酸化的CagA激活SHP2/ERK，而未磷酸化的CagA激活JAK/STAT3途径[20]。

Gp130757F/F小鼠模型主要用于研究gp130配体在炎症反应、免疫应答和淋巴结转移中的信号转导作用。细胞因子白细胞介素11(interleukin-11, IL-11)和IL-6是gp130的主要配体。IL-11通过经典途径激活STAT1/3，是gp130信号转导的关键因子[21]。作为潜在的治疗靶点，IL-11通过gp130/JAK/STAT3/Bcl-2途径参与胃癌化疗药物的耐药作用，靶向IL-11治疗可能是克服耐药的新策略[22]。IL-6在胃窦中的活性较低，与肿瘤侵袭相关，而与肿瘤生长无关[23]。除炎症反应外，宿主免疫应答在肿瘤进展过程中亦发挥重要作用。免疫相关基因Toll样受体2(Toll-like receptor 2, TLR2)和髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)可被STAT3激活，以不依赖炎症的方式调节胃肿瘤细胞增殖和凋亡[24-25]。最新研究[26]还发现，gp130757F/F小鼠胃窦黏膜下层富含淋巴样的聚集体，其中gp130/STAT3信号轴可驱动体内胃肿瘤的三级淋巴结构发展，促进胃癌的发生和转移。Gp130757F/F小鼠遵循经典的肠型胃癌发展序列，与人类肿瘤相似度极高，研究胃癌免疫细胞的免疫效应以及转移和侵袭性表型可选择该模型。

四、H/K-ATPase-IL-1β小鼠

IL-1β是一种多效的促炎因子，具有强烈的抑酸作用。通过抑制细胞内钙离子的释放，IL-1β可抑制Sonic Hedgehog(Shh)基因表达[27]。Shh是Hedgehog蛋白家族成员，能调节胃上皮细胞分化，诱导胃内氢-钾-ATP酶(H/K-ATPase)表达。利用鼠H/K-ATPase启动子构建特异性表达人IL-1β的小鼠模型，即H/K-ATPase-IL-1β小鼠[28]。该小鼠表现为自发性胃炎、胃萎缩、肠化生，直至进展为胃癌。Hp与IL-1β协同参与胃肿瘤的发生、发展。与IL-1β作用类似，Hp感染抑制壁细胞Shh表达和H/K-ATPase转录[27]。敲除小鼠IL-1β基因，Hp感染引起的巨噬细胞和中性粒细胞募集减少，NF-κB活化减少[28]。由此推测，IL-1β可能是Hp感染的最终致病途径。

H/K-ATPase-IL-1β小鼠模型目前被广泛用于研究肿瘤早期的启动机制、癌相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)以及基质细胞在肿瘤微环境中的作用。通过激活NF-κB途径，IL-1β募集胃内骨髓来源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)[28]，对早期肿瘤的发生具有重要作用。至少20%的CAFs来源于骨髓间充质干细胞。IL-1β可诱导CAFs中的信号传导，促进肿瘤向胞外基质和淋巴管侵袭[29]。在此过程中，基质细胞衍生因子-1募集MDSCs，促进胃异型增生[30]。此外，H/K-ATPase-IL-1β小鼠是检测胃癌表观遗传学变化的重要工具。IL-1β可直接诱导胃肿瘤细胞的DNA甲基化[31]，表明炎症因子可直接触发表观遗传学变化来促进胃病发展，揭示了炎症与胃癌之间的新机制。

五、其他

原癌基因K-ras的激活涉及多种恶性肿瘤的发生。将特异表达于胃颈/峡部的角蛋白19(keratin 19, K19)与K-ras融合，构建K19-K-ras-V12突变模型。结果显示小鼠3个月时出现泌酸腺萎缩和黏液性化生，20月龄发生高度异型增生和黏膜下浸润[32]。另一种K-ras突变模型由CK19CreERT基因插入LSL-K-rasG12D小鼠构成，这种小鼠早期出现SPEM、肠化生和胃祖细胞激活现象，与人癌前病变相似[33-34]。因此，具有K-ras突变的小鼠模型常用于研究早期胃癌的分子事件。

K19-Wnt1小鼠胃黏膜能特异表达Wnt1蛋白、环氧合酶2(cyclooxygenase 2, COX-2)和前列腺素E2[35]。K19-Wnt1小鼠与K19-C2mE小鼠杂交生成K19-Wnt1/C2mE小鼠，5周龄时可发生黏液性化生，20周龄时形成胃肿瘤[35]。这种小鼠模型主要用于探索Wnt途径、COX-2和血管抑制素2等在胃癌生成中的机制[36]。

Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4, KLF4)是锌指转录因子，主要表达于上皮细胞。KLF4敲除(KLF4-/-)小鼠由Villin-Cre+小鼠和Klf4fl/fl小鼠杂交培育而成，病理表现为胃上皮细胞增殖增加和分化改变，35周龄时形成胃窦前肿瘤，80周龄时29%小鼠发生胃窦肿瘤[37]。这种模型可用于胃窦干细胞诱导的自发性肿瘤研究。

六、结语

理想的动物模型是研究胃癌发病机制和改进治疗策略的重要前提。基因工程小鼠直接将调控胃癌的特定基因转染至胚胎组织中形成原发性肿瘤，其肿瘤进展过程和形态特征与人类肿瘤相似(表1)。这些小鼠对研究基因突变、信号通路、药物研发以及药效评估具有独特的优势，是极为理想的实验模型。近年来，基因编辑技术CRISPR/Cas9被用于构建各种基因修饰的动物模型。有研究利用CRISPR/Cas9技术构建TFF-/-小鼠，这种新培育的模型的病理表型与以往研究一致[38]。另一项研究[39]则在gp130757F/F小鼠中敲除凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)，从而探讨胃癌发生的新机制。CRISPR/Cas9基因编辑技术结合传统的基因工程小鼠模型，可从分子水平进行单基因或多基因的敲除，避免既往单基因突变模型带来的缺陷，更贴近人类肿瘤发生的特点，有望成为未来肿瘤研究的主流工具。本文从小鼠模型的造模方式、病理表型、与Hp感染的相关性、适用领域等角度进行总结，对胃癌的基础研究具有重要的参考价值。

表1 基因工程小鼠胃癌模型汇总