Foxa2在结直肠息肉和结直肠癌中的表达及其意义

彭 好 沈 磊

武汉大学人民医院消化内科(430060)

背景：叉头框蛋白A2(Foxa2)在结直肠癌的增殖和远处转移中具有重要作用，但关于Foxa2在结直肠息肉中的表达未见相关报道。目的：探讨Foxa2在结直肠息肉和结直肠癌中的表达及其意义。方法：选取2018年1月—2019年5月至武汉大学人民医院收治的45例增生性息肉、135例腺瘤性息肉和45例结直肠癌及其相应癌旁正常黏膜组织。采用免疫组化SP法检测Foxa2表达情况，实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别检测Foxa2 mRNA和蛋白表达，并分析Foxa2表达与结直肠息肉、结直肠癌之间的关系。结果：Foxa2在正常结直肠黏膜组织、增生性息肉、腺瘤性息肉、结直肠癌中的阳性表达率分别为13.3%、31.1%、62.2%、86.7%，组间相比差异有统计学意义(P<0.05)。正常结直肠黏膜组织、增生性息肉、腺瘤性息肉、结直肠癌中Foxa2 mRNA和蛋白表达逐渐增高，组间相比差异有统计学意义(P<0.05)。Foxa2表达与腺瘤性息肉的大小、是否带蒂有关(P<0.05)；与结直肠癌分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05)。结论：Foxa2在腺瘤性息肉和结直肠癌中高表达，且随着息肉癌变风险提高而增高，因此检测结直肠息肉组织中Foxa2蛋白表达有助于早期发现结直肠癌。

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一[1]。随着饮食结构的改变，我国结直肠癌的发病率呈逐渐上升的趋势[2]。结直肠息肉是结直肠黏膜的隆起性病变，常见病理类型包括炎性息肉、增生性息肉、腺瘤性息肉等，其中腺瘤性息肉属于结直肠癌的癌前病变[3]。目前关于腺瘤性息肉癌变的机制尚不清楚。从分子生物学角度研究腺瘤性息肉与结直肠癌之间的关系，对于预防、诊断、治疗结直肠癌具有重要意义。叉头框蛋白A2(forkhead box A2, Foxa2)又称为肝细胞核因子3β(hepatocyte nuclear factor 3β, HNF3β)，其能与DNA启动子区结合来调节基因的表达，在细胞分化、细胞代谢中发挥重要作用[4-5]。有研究[6]表明，Foxa2能促进结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭。本研究通过检测不同类型结直肠息肉以及结直肠癌中Foxa2的表达，旨在探讨Foxa2、结直肠息肉、结直肠癌三者之间的关系，从而为预防、诊断、治疗结直肠癌提供一种新手段。

材料与方法

一、临床资料

收集2018年1月—2019年5月至武汉大学人民医院消化内镜中心行内镜下切除的增生性息肉45例、腺瘤性息肉135例，其中管状腺瘤、管状绒毛状腺瘤、绒毛状腺瘤各45例，另取外科手术切除的结直肠癌及其配对的正常结直肠黏膜(距肿瘤边缘>5 cm)组织各45例。在180例息肉患者中，男107例，女73例，年龄26～81岁，平均(55.60±14.16)岁；45例结直肠癌患者中，男22例，女23例，年龄40～79岁，平均(62.78±9.20)岁。根据2000年WHO消化系肿瘤分类标准，高中分化腺癌17例，低分化腺癌28例；无淋巴结转移15例，有淋巴结转移30例；TNM分期采用国际抗癌联盟2009年发布的第7版分期标准，Ⅰ+Ⅱ期19例，Ⅲ+Ⅳ期26例。收集的各组样本组织立即置于液氮中，-80 ℃保存。

二、方法

1.免疫组化SP法：将4 μm厚的石蜡切片进行二甲苯脱蜡、乙醇水合、蒸馏水浸洗后，置于0.01 mol/L MEDTA缓冲液(pH 9.0)中，微波炉热修复25 min，TBS冲洗。0.3%双氧水去除内源性过氧化物酶，滴加小鼠抗人Foxa2抗体(稀释浓度1∶100，美国R&D公司)，PBS代替一抗作为阴性对照，于4 ℃湿盒子中孵育15 h，加酶标二抗，0.25% Triton X-100室温破膜10 min，TBS冲洗。DAB显色(购自Agilent Technologies, Inc.)，苏木素复染，脱水、封片，显微镜下观察和采集图像。

结果判定：Foxa2免疫组化阳性产物呈棕黄色或棕褐色，主要位于细胞核内，部分组织中因转录因子表达的不同时相，可在胞质或胞膜上特异性表达。高倍镜(×400)下随机选取4个视野，评估染色的阳性程度和阳性面积。阳性强度：无色，0分；黄色，1分；棕黄色，2分；棕褐色，3分。阳性面积：<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。染色总分为强度与阳性面积之积，总分0分为不表达，1～3分为弱表达，4～6分为中度表达，7～9分为强表达，将0～3分定义为阴性，4～9分定义为阳性。

2.实时荧光定量PCR法检测Foxa2 mRNA含量：提取各组组织RNA，反转录合成cDNA。行实时荧光定量PCR法，反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环。Foxa2引物由天一辉远生物科技有限公司合成，引物序列上游：5’-GCG ACC CCA AGA CCT ACA G-3’，下游：5’-GGT TCT GCC GGT AGA AGG G-3’；以GAPDH作为内参，上游：5’-CAT GAG AAG TAT GAC AAC AGC CT-3’，下游：5’-AGT CCT TCC ACG ATA CCA AAG T-3’。采用2-△△Ct法计算Foxa2 mRNA相对表达量。实验重复3次，取均值。

3.蛋白质印迹法检测Foxa2蛋白表达：各组组织匀浆离心后制成细胞裂解液，行SDS-PAGE电泳，然后转移至PVDF膜。加入一抗GAPDH(杭州贤至生物科技有限公司)、Foxa2(R&D Systems)，稀释比例为1∶1 000，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5～6次。加入HRP的标记二抗(武汉博士德生物工程有限公司)(1∶50 000稀释)，37 ℃摇床孵育2 h，TBST充分洗涤。显色，摄片。采用Image J图像分析软件测定条带灰度值，以Foxa2条带灰度值与GAPDH灰度值的比值作为Foxa2蛋白的相对表达。

三、统计学分析

结 果

一、Foxa2蛋白在不同病理组织中的表达

不同组别中Foxa2表达见图1。与正常结直肠黏膜组相比，增生性息肉组、腺瘤性息肉组、结直肠癌组Foxa2表达率均显著升高(31.1%、62.2%、86.7%对13.3%，P<0.05)；与增生性息肉组相比，腺瘤性息肉组、结直肠癌组Foxa2表达率均显著升高(P<0.05)；结直肠癌组又显著高于腺瘤性息肉组(P=0.002)。此外，腺瘤性息肉组中Foxa2表达率随着绒毛含量的增加而有所升高，但组间差异无统计学意义(P>0.05；表1)。

在135例腺瘤性息肉中，低级别上皮内瘤变为57例，阳性表达率为61.4%(35/57)；高级别上皮内瘤变为8例，阳性表达率为75%(6/8), 两者之间差异无统计学意义(P=0.723)。

二、Foxa2 mRNA表达

Foxa2 mRNA在正常组织、增生性息肉、腺瘤性息肉、结直肠癌中的表达逐渐增加，且两两之间差异有统计学意义(P<0.05;图2、表2)。

A：正常结直肠黏膜；B：增生性息肉；C：管状腺瘤；D：管状绒毛状腺瘤；E：绒毛状腺瘤；F：结直肠癌

图1 Foxa2蛋白在不同病理组织中的表达(免疫组化SP法，×400)

表1 不同病理组织中Foxa2表达情况

*与正常结直肠黏膜组比较，P<0.05；#与增生性息肉组比较，P<0.05；▲与腺瘤性息肉组比较，P<0.05

1：正常结直肠黏膜组；2：增生性息肉组；3：腺瘤性息肉组；4：结直肠癌组

a与正常结直肠黏膜组比较，P<0.05；b与增生性息肉组比较，P<0.05；c与腺瘤性息肉组比较，P<0.05

图2 不同病理组织中Foxa2 mRNA表达(实时荧光定量PCR法)

表2 各组组织中Foxa2 mRNA和蛋白表达情况

*与正常结直肠黏膜组比较，P<0.05；#与增生性息肉组比较，P<0.05；▲与腺瘤性息肉组比较，P<0.05

三、Foxa2蛋白表达

Foxa2蛋白含量在正常组织、增生性息肉、腺瘤性息肉、结直肠癌中的表达逐渐增加，且两两之间差异有统计学意义(P<0.05;图3、表2)。

1：正常结直肠黏膜组；2：增生性息肉组；3：腺瘤性息肉组；4：结直肠癌组

a与正常结直肠黏膜组比较，P<0.05；b与增生性息肉组比较，P<0.05；c与腺瘤性息肉组比较，P<0.05

图3 不同病理组织中Foxa2蛋白表达(蛋白质印迹法)

四、Foxa2表达与临床病理参数之间的关系

Foxa2表达与腺瘤性息肉大小、是否有蒂有关(P<0.05)，而与患者的性别、年龄、息肉部位均无明显相关性(P>0.05；表3)。Foxa2表达与结直肠癌的分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05；表4)。

表3 Foxa2表达与结直肠腺瘤性息肉患者临床病理参数的关系(n)

*近端结直肠：距肛缘≤7 cm；远端结直肠：距肛缘>7 cm

表4 Foxa2表达与结直肠癌患者临床病理参数的关系(n)

讨 论

结直肠癌发生的原因复杂多样，涉及多基因、多因素的相互作用。结直肠腺瘤为目前公认的结直肠癌癌前病变，因此，对结直肠息肉性质的准确判断以及防治是预防结直肠癌发生的重要手段。目前，早期诊断结直肠癌的常用分子生物学标志物包括SEPT9、vimentin、癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白20(CK20)、表皮生长因子受体(EGFR)等[7]。近年有研究发现Foxa2在结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭等过程中具有一定作用[6]。本实验通过对正常结直肠黏膜、增生性息肉、腺瘤性息肉、结直肠癌等组织中Foxa2的表达进行研究，并探讨Foxa2、腺瘤性息肉、结直肠癌三者之间的关系，旨在为Foxa2预测结直肠息肉的癌变风险提供理论依据。

有研究表明，结直肠癌的发生、发展与Wnt-β-catenin、Hedgehog等信号通路关系密切[8-10]。Foxa2蛋白是一种调节基因转录和修复基因的DNA结合蛋白，通过结合顺序调控序列来调节相关目标基因的表达，参与细胞增殖和分化过程，其表达异常与多种肿瘤的发生、发展密切相关，如膀胱癌[11]、乳腺癌[12]、肺癌[13]、肝癌[14]、胰腺癌、甲状腺癌等。有研究[15]证实，在食管腺癌形成过程中，Hedgehog信号通路被激活，从而诱导其下游目的基因Foxa2的表达，导致食管腺癌组织中Foxa2蛋白表达增加。Villacorte等[16]的研究发现，在子宫内膜腺癌形成过程中，Wnt/β-catenin信号通路通过调节Foxa2基因及其上游区域，控制细胞周期从而调节细胞增殖。另一项研究[17]发现，Foxa2基因与其邻近基因lncRNA-NEF相互促进表达，抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而抑制肝癌细胞的上皮-间质转化和远处转移。上述研究结果提示Foxa2可通过Wnt/β-catenin、Hedgehog等信号通路在肿瘤的形成和发展中起有重要作用。

本研究结果发现，Foxa2在增生性息肉中的表达率明显高于正常结直肠黏膜(P<0.05)。这可能是增生性息肉产生过程中，Hedgehog信号通路有所上调，激活下游目标基因Foxa2的表达。腺瘤性息肉和结直肠癌中Foxa2表达率明显高于增生性息肉，这可能是在腺瘤性息肉发生和发展过程中，Wnt/β-catenin信号通路和Hedgehog信号通路共同激活Foxa2表达所致[18]。进一步研究发现，分化程度越低、TNM分期越晚、有淋巴结转移的结直肠癌组织中，Foxa2表达阳性率越高。Wang等[6]的研究发现，siR-Foxa2干扰组HCT116和HT29细胞出现G1/S期阻滞，细胞远处转移和侵袭减少，提示下调Foxa2可抑制结直肠癌细胞增殖、远处转移。本研究中，腺瘤性息肉组织中Foxa2表达随息肉绒毛含量的增加而增加，但差异并无统计学意义(P>0.05)；高级别上皮内瘤变中的表达高于低级别上皮内瘤变，差异亦无统计学意义(P>0.05)；Foxa2表达在高级别上皮内瘤变组与结直肠癌组之间差异无统计学意义(P=0.754)，但低级别上皮内瘤变组与结直肠癌组之间差异有统计学意义(P=0.005)；Foxa2表达与腺瘤性息肉大小、是否有蒂有关(P<0.05)，而与患者的性别、年龄、息肉部位均无关(P>0.05)。说明Foxa2蛋白表达随着结直肠息肉恶变风险的增加而明显增强，息肉大小、是否有蒂可影响Foxa2蛋白的表达。

综上所述，Foxa2在结直肠腺瘤性息肉和结直肠癌中高表达，且随着息肉癌变风险提高而增加。因此，通过检测Foxa2表达有望预测结直肠息肉癌变风险。但Foxa2参与结直肠息肉癌变和结直肠癌发生、发展的机制尚不明确，有待进一步深入研究。