外泌体源性miRNAs在肝脏疾病发生发展中作用的研究进展

戢敏，陈星，喻雪琴，陈芳，梅怡晗，梅小平

(1川北医学院附属医院，四川南充 637000；2首都医科大学)

肝脏疾病的发病机制十分复杂，其涉及到的致病因素包括各种肝炎病毒、药物、乙醇等，疾病到后期可进展为肝硬化、肝癌，对人类健康影响较大。肝组织活检是某些肝脏疾病诊断的金标准，但其临床应用有一定的局限性。近年来发现，外泌体及外泌体源性微小RNA(miRNAs)是由多种细胞分泌到细胞外的一种双层囊泡小体(外泌体)及物质，起初外泌体被认为是一种人体内的代谢废物，随着研究的深入，人们发现外泌体具有丰富的作用，如细胞信号传导、基因调控、免疫调节等。近年研究发现，外泌体及其外泌体源性miRNAs参与了肝脏疾病的发生发展，是肝脏疾病诊治的潜在生物标志物，这为临床上早期诊断与治疗肝脏疾病提供了新思路。现就外泌体源性miRNAs在肝脏疾病发生发展中的作用进行综述。

1 外泌体源性miRNAs的生物学特征

外泌体是在1987年由Johnston等[1]在哺乳动物成熟红细胞中发现的，其直径为30～100 nm,密度为1.10～1.20 g/mL，可由B淋巴细胞、T细胞、树突状细胞、神经细胞等多种细胞释放[2]，其在外周血、尿液、唾液、羊水及腹水等体液中均可检出[3,4]。外泌体可携带蛋白质、细胞因子、转录因子受体、mRNA和miRNAs等多种生物活性物质，并可在体液中稳定表达与循环，具有物质转运“载体”，细胞转运和信号传导作用，并且在机体的正常生理及病理过程中发挥调节作用，如抗原提呈、诱导肿瘤细胞的发生与迁徙、促进组织损伤后的愈合、靶细胞的活化、增殖、分化与凋亡、病毒的复制与抑制等[5]。Valadi等[6]在2007年研究发现：机体外泌体是由肥大细胞分泌产生的，可将miRNAs、mRNA以及mRNA翻译产生机体生理与病理状态所需要的蛋白质，及信号物质传递到靶细胞，从而初步认为，外泌体具有在细胞间选择性地输送RNA分子的功能，但其作用机制尚不清楚。有研究[7]发现，体液特别是外周血中的外泌体是miRNAs的主要来源，对miRNAs起保护作用，阻止其不受RNA酶的降解，使其能在体液中长时间稳定表达并被稳定地检出。有研究显示，不同肝脏疾病的多类型细胞都能分泌受外泌体产生与保护的miRNAs，在相应肝脏疾病细胞中miRNAs表达水平发生变化时，其受外泌体影响与保护的miRNAs也会出现同步变化，其miRNAs表达水平变化幅度比外泌体更大，这种现象称为“miRNAs放大效应或海绵效应”。miRNAs是一段长度为19～23 nt的内源性非编码单链分子，可与Ago2形成RNA诱导沉默复合体，以完全配对或不完全配对方式与mRNA的3′端非编码区结合发挥降解或沉默靶细胞中mRNA的表达。血清、血浆、尿液、乳汁等体液中存在着大量的miRNAs,其循环体液中miRNAs谱的异常表达与许多疾病的发生发展密切相关[8]，并且体液中的miRNAs能作为某些疾病诊断的新型标志物与治疗靶标[9]。

2 外泌体源性miRNAs在肝脏疾病发生发展中的作用

2.1 外泌体源性miRNAs在脂肪性肝病发生发展中的作用 肝细胞通过外泌体可诱导细胞因子表达水平发生变化,从而发挥机体免疫诱导与调节作用，进而调控肝组织炎症反应的发生与发展。在我国，脂肪肝多分为酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝(NAFLD)。有研究[10]发现，酒精性脂肪肝小鼠外周血中外泌体高表达，采用miRNA芯片研究也显示，酒精性脂肪肝小鼠的外周血及肝组织中miRNAs高表达。Saha等[11]研究发现，乙醇可以诱导人单核细胞释放富含miRNA-27a的外泌体，而外泌体可刺激原始单核细胞的极化或提高其活性，使原始单核细胞分化为M2巨噬细胞，诱导炎性因子分泌与高表达，增强巨噬细胞的吞噬功能。另一项研究[12]显示，乙醇诱导肝细胞分泌的外泌体，其释放与激活半胱天冬酶3依赖的通路有关，而该外泌体中含有的CD40配体能够促使巨噬细胞的活化，诱导和促进酒精性肝病的炎性反应。NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者分泌的外泌体，主要是由自然杀伤T细胞和巨噬细胞产生。NAFLD小鼠模型囊泡中miRNAs表达明显增加，表达模式多样化[13]。研究结果显示，病理状态下的细胞能诱导独特物质囊泡水平高表达，从而诱导疾病的病理生理变化过程。脂质高水平表达可诱导原代肝细胞和肝癌细胞系Huh7细胞囊泡的释放，并活化巨噬细胞，促进炎症反应的发生，从而引发NASH[14]。此外，胆碱缺乏L-氨基酸(CDAA)喂养小鼠分泌的外泌体中miR-122、miR-192高表达。在NAFLD进展期间，囊泡中的miRNAs随时间推移表达逐渐增高，而在肝脏中逐渐呈现低表达。这些研究表明，miRNAs在肝脏病理生理学中发挥了重要的调控作用，miRNAs在肝脏疾病中的表达水平差异和模式是不相同的，其发生机制有待进一步研究。

2.2 外泌体源性miRNAs在慢性肝炎发生发展中的作用 外泌体源性miRNAs在慢性肝炎的发生发展中起到了双刃剑的作用。一方面，外泌体源性miRNAs能影响机体的免疫反应，HBV感染肝实质细胞后，诱导肝细胞的正常生理病态化，外泌体源性miRNAs包裹的蛋白质参与了肝细胞的正常代谢调节；同时，HBV感染肝细胞后诱导分泌的外泌体源性miRNAs具有致病信号的传递作用，外泌体源性miRNAs可能参与病毒间或病毒与靶细胞间相关信息的传递作用以及疾病的发生发展与免疫调节过程[15]，从而使外泌体源性miRNAs成为HBV等病毒传播的路径[2]。Kouwaki等[16]研究发现，感染HBV的肝细胞能释放含有HBV核酸的外泌体源性miRNAs，能诱导巨噬细胞高表达与NK细胞及配体的激活作用，在NK细胞激活后，进而促进机体在病毒感染初期诱导产生IFN-γ并高表达，以促进肝细胞核中HBV核酸的降解与清除，达到抗病毒作用。然而有研究[17]显示，慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血中含HBV的外泌体源性miRNAs起负性调节作用，这种外泌体源性miRNAs能诱导和促进NK细胞水平下降与功能受损，导致IFN-γ水平下降；对NK细胞的增殖和存活发挥抑制作用，是HBV逃逸宿主固有免疫的主要发生机制。通过对20例CHB患者外周血外泌体源性miRNAs研究比较发现，其外泌体源性miRNAs表达水平上调的有：miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224，下调的有：miR-101、miR-106b、miR-122、miR-195，但也有外泌体源性miRNAs表达无显著性变化的[18]，如miR-21等。还有研究显示，HCV感染肝细胞后分泌的外泌体源性miRNAs包裹病毒RNA，而这些外泌体源性miRNAs可进一步感染新的肝细胞，提示外泌体源性miRNAs在HCV感染扩散过程中也具有非常重要的再感染作用[19]。有学者研究发现，HCV感染的肝实质细胞分泌的外泌体源性miRNAs中包含有miR-19a，其可直接激活肝星状细胞(HSC)的STAT3-TGF-β信号通路，诱导和促进肝组织纤维化的发生发展[20]。

2.3 外泌体源性miRNAs在肝纤维化及肝硬化发生发展中的作用 肝纤维化是各种因素导致肝细胞间细胞外基质(ECM)过度沉积的一种病理状态，它与HSC活化、增殖、分化与凋亡密切相关。外泌体源性miRNAs能调节HSC的活化、增殖、分化、凋亡及迁移，诱导活化的HSC数量与功能增加，这在肝纤维化发生发展过程中起到了关键的调控作用。Seo等[21]研究发现，肝细胞损伤后可以分泌含有Toll样受体3配体的外泌体源性miRNAs，激活HSC的Toll样受体3，诱导和促进γδ T淋巴细胞分泌大量的IL-17A，高表达的IL-17A能诱导和促进肝纤维化的形成。Charrier等[22]研究发现，激活后的HSC能分泌含有结缔组织生长因子(CTGF)2的外泌体源性miRNAs，并在HSC之间发挥信号通路的传递作用。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是HSC活化的标志蛋白，外泌体源性miRNAs能促进α-SMA和胶原纤维的高表达，促进肝纤维化的发生与形成。外泌体源性miRNAs除了能调节HSC活化外，还与HSC迁移关系密切。动物实验结果显示，四氯化碳诱导建立形成的肝纤维化或肝硬化小鼠，外周血中外泌体源性miRNAs高表达，可促进HSC活化、增殖与ESM的形成；这可能与外泌体中的鞘氨醇激酶1/鞘氨醇-1-磷酸酯在HSC的活化、增殖与ESM的形成及迁移过程中所发挥的关键性作用相关[23]。在肝纤维化与肝硬化患者中，窦内皮细胞数量减少与功能失衡将会导致门脉高压。研究发现，HSC能够释放含有Hedgehog配体的外泌体源性miRNAs到窦内皮细胞，诱导窦内皮细胞数量与功能失调，初步认为外泌体源性miRNAs可诱导和促进肝纤维化与肝硬化所致的门脉高压的发生。另外，也有研究显示，来源于原发性胆汁性肝硬化外周血中的外泌体源性miRNAs能选择性地诱导不同亚群抗原递呈细胞共刺激分子的高表达[24]，这也可能是导致肝硬化及门脉高压发生的又一原因。外泌体源性miRNAs中的miR-214表达下调明显，推测miR-214可能是一种潜在的诊断肝组织纤维化的标志物之一，但miR-214在肝组织发生纤维化中表达下调机制尚不明确，有待进一步研究[25]。

2.4 外泌体源性miRNAs在肝癌发生发展中的作用 Sohn等[26]研究发现，与肝硬化患者比较，原发性肝癌(HCC)患者外周血中外泌体源性miRNAs表达升高明显，其中高表达的有：miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224，低表达的有：miR-101、miR-106b、miR-12和miR-195。有研究发现，肝癌组织中miRNA-10b的表达与预后呈正相关，同时miRNA-10b、miRNA-200A和miRNA-122与肝硬化的形成关系密切，具有调节上皮间质转化与ECM形成的作用，进而诱导和促进了肝硬化的发生与发展；认为miRNA-10b、miRNA-200A和miRNA-122的表达高低可作为诊断肝硬化相关肝癌的标志物之一[27]。研究发现，miR-21在肝纤维化、肝硬化、肝癌等疾病中是一种具有疾病鉴别诊断意义较高的外泌体生物标志物，具有与miR-122作用相反的功能。miR-122是在肝组织中丰度表达最高的miRNA,参与了肝脏组织的脂质代谢过程[28]，miR-122在部分肝癌组织中表达下调，且与肝癌患者预后、复发与转移关系密切[29]。同时有研究发现，miR-21在肝癌的发生中具有重要的调控作用，在肝癌患者肿瘤组织内异常高表达，且miR-21高表达预示肝癌患者的生存期更短[30,31]。有研究比较了30例HCC患者与30例慢性HBV感染患者的外周血miR-21表达水平，发现HCC患者外周血中miR-21表达异常增高；另外一项研究比较了20例肝癌患者和20例CHB患者的外泌体源性miRNAs发现：尽管在肝癌及CHB患者外周血中miR-21的表达没有显著性差异，但肝癌患者miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224表达较CHB患者明显上调，而miR-101、miR-106b、miR-122和miR-195表达明显下调[23]。这些研究表明，外泌体源性miRNAs在肝脏疾病中表现多样和不稳定，有待进一步研究表达水平稳定并具有特异性的外泌体源性miRNAs来作为HCC等肝脏疾病的标志物。

目前，肝组织活检仍然是诊断肝脏疾病的金标准，而对外泌体及其内容物的研究，为肝脏相关疾病提供了无创检查的可能，有希望应用于肝脏疾病的早期诊断以及药物疗效的检测。此外，外泌体源性miRNAs靶向细胞作用机制尚不明确，因此外泌体源性miRNAs所介导细胞间的信号通路激活与抑制仍是今后研究的方向之一。