高通量聚合酶链式反应技术的研究进展

湛玉霞，罗光华

(苏州大学附属第三医院，江苏常州213000)

随着分子生物学的不断发展，基因在疾病诊治中发挥着越来越重要的作用。从基因与疾病的关联、微生物检测到耐药基因筛查，基因检测已成为临床常规检测项目之一。基因测序技术是基因检测的“金标准”，该技术通过Sanger脱氧测序法等不同方法呈现待检基因的碱基序列，为精确的疾病诊断和病因分析提供依据[1]。但基因测序技术检测周期偏长、成本偏高，而且需要特殊的仪器设备，难以普及应用。聚合酶链式反应(PCR)技术利用DNA在DNA聚合酶作用下按照碱基互补配对原则合成子代DNA，在配置合适反应体系后，选择最佳反应温度，通过变性、退火、延伸三个基本步骤，经过约25个循环就能在体外完成少量靶序列的大量扩增[2]。PCR技术不需要昂贵的仪器和试剂，操作简单，检测周期短，适用于临床标本的大规模筛检。传统PCR的单管单基因检测存在出通量过小、大批量多基因检测耗时长的弊端。随着科技的进步，PCR方案不断创新和优化，兼具普通PCR简单高效和高通量的优点的多重PCR在基因检测领域备受关注。多重PCR是指单管中放置2对及以上的不同特异性引物同时扩增2种以上的靶基因，是实现高通量PCR检测的基础[3]。由于多重PCR技术在多对引物存在的情况下，扩增所得常常出现混合产物的情况，产生了产物鉴定方案上的分歧。因此根据产物鉴定方法的不同，将高通量PCR技术分为开管检测PCR和闭管检测PCR。本文将对这两大类高通量PCR检测技术的研究现状进行综述。

1 开管高通量PCR检测技术

开管检测高通量PCR技术在目的基因扩增完成后，需要将反应管打开取出产物进行检测。开管产物检测主要采用电泳法、质谱法或测序法等。

1.1 多重PCR-电泳联用检测技术

1.1.1 多重PCR-琼脂糖凝胶电泳联用技术 琼脂糖凝胶电泳法鉴定PCR产物是应用最多、使用历史最长的方法[4]。其原理和操作都很简单，即在缓冲体系合适的琼脂糖凝胶点样孔中加入多重PCR产物，选取适宜的电压电泳一段时间后，对凝胶板染色拍照并进行图像分析，利用核酸分子在电泳过程中的电荷或分子筛效应等对产物进行分离和检测[5]。产物条带有定性和半定量的作用。多重PCR-琼脂糖凝胶电泳联用技术在基因检测领域应用范围较广，主要用于基因表达检测。

相较于基因测序，凝胶电泳成本低、操作简单，有定性和半定量两种功能，实用性强。根据所要分析样本的不同还可以对反应条件进行调整。但是琼脂糖凝胶电泳结果准确性对操作人员的技术规范依赖程度高，点样过程出现点样不均、移液枪枪头残留对产物量的判断影响很大，而且由于是开管操作，PCR产物造成实验室污染的风险较大，所以在批量样本检测中存在弊端[6]。

1.1.2 多重PCR-毛细管电泳联用技术 开管检测高通量PCR检测技术中，采取PCR-毛细管电泳联用方案提高通量的技术有很多，如GeXP多重PCR、多重连接探针扩增技术等。毛细管电泳法是一种新型高效液相分离方法，融合了普通电泳和色谱的技术，通过电泳淌度、电渗淌度，具有高通量、高效、快速分离鉴别待测样品的优势。

1.1.2.1 多重连接依赖式探针扩增PCR技术 多重连接依赖式探针扩增(MLPA)PCR技术的特点在于独特的引物设计使得只有互补良好时才能完成PCR扩增[7]。MLPA引物包括连接引物和PCR引物，其中连接引物由一个长引物和一个短引物组成，长引物分为杂交序列区、M13源序列和PCR引物结合序列，短引物为PCR引物结合序列和杂交序列区域[8]。杂交序列区的作用是与靶序列结合，长引物及短引物分别结合在靶基因两端，仅在杂交情况良好时才能通过连接酶将引物之间的空缺填补，才能生成第一链产物[9]。第一链产物合成后，PCR引物与连接引物上的PCR引物结合序列区杂交，引导完成PCR扩增。当发生基因缺失时，长短引物的杂交序列区无法被连接酶连接。产物鉴别使用毛细管电泳法，根据峰值对产物进行定性和半定量。MLPA PCR技术能够同时检测40多种核苷酸序列的拷贝变化[8, 10]，主要应用于遗传学领域，用于检测染色体数目异常、基因片段缺失或重排等。

MLPA技术对引物的改进是其突出特点也是优势，长引物的设计使得其具体长度可以人为进行调试，方便最后产物的鉴定。MLPA引物两端PCR引物序列均相同的设计使得在PCR扩增程序中，添加一对引物就能同时扩增多种基因，结合毛细管电泳法的优势，产物直接利用峰值进行定性和半定量，更为简便迅速，经济效益也得到提高。但该技术也存在电泳法鉴定产物的污染风险问题。

1.1.2.2 GeXP多重PCR技术 GeXP多重PCR扩增是在每一对特异性引物末端添加一段称之为通用标签的核酸序列。每一对正义引物和反义引物的标签序列不同，但不同类别的正义引物的标签序列相同，不同反义引物的标签序列也相同。根据PCR的反应原理，扩增后产物两条链5′端会分别带上正义反义引物上的标签序列。此时通用标签就能发挥保证在多重PCR体系中各个靶基因达到等效扩增的作用，优化多重PCR的扩增效率。随后利用毛细管电泳技术，分析待测产物的大小。GeXP多重PCR的探针设计靶向于通用标签，在PCR产物纯化后，可以通过收集荧光信号，判断反应体系中产物量的多少，根据荧光信号的强度反映监测样本中的基因数目。GeXP多重PCR技术在病原体检测分型领域应用较多，如呼吸道病毒[11]、手足口病病毒、人乳头状病毒筛查分型[12]等。

GeXP多重PCR扩增技术的优点包括：GeXP多重PCR技术通量大，应用范围广；通用标签的应用使得各个产物之间可以达到等效扩增；将荧光和电泳结果结合，能够完成定性和定量。该技术的缺点是PCR产物在开盖操作过程中容易飞出而导致实验室污染，易产生假阳性。

1.2 多重PCR-质谱联用技术 PCR技术与质谱技术相结合，直接将产物或者处理后的目的片段加入质谱仪完成产物鉴定。

1.2.1 质量标签PCR(Mass-tag PCR)技术 Mass-tag PCR是一种在引物末端添加质量标签的PCR技术。引物设计合理时，其PCR反应体系中可以加入15对以上的引物，有研究提示这种PCR技术能够同时扩增30种左右的靶基因序列。Mass-tag PCR技术对每一个特异性引物的5′末端进行修饰后与质量标签连接，形成一种可以被光剪切的特殊共价键。每一对引物的正义引物与反义引物所带的质量标签不同。Mass-tag PCR每一个引物所带的质量标签都是独特的。在PCR扩增时，由于特异性引物带有质量标签，产物也具有与相应引物相同的质量标签。扩增完成后，将产物进行纯化，去除原反应体系中多余的成分，避免未参与反应的引物标签对检测带来干扰。纯化后的产物经过紫外照射，收集两端的被切割下来的质量标签，用质谱仪进行分选[13]。Mass-tag PCR主要用于微生物病原体的筛检，能够同时筛检多种病原体，减少临床漏诊率。

Mass-tag PCR具有以下优点：独特的质量标签起到定性、半定量的作用；这种标签不存在和目的基因或其他引物非特异性杂交的现象；不需要额外的探针；可以选用的质量标签种类多，只要设计的引物合适，就能达到比较大的检测通量。该技术的缺点在于操作过程中涉及3个开盖步骤，分别是在纯化、标签剪切、质谱3个环节中，容易造成产物污染。再者，质量标签的采用对引物设计和仪器设备具有特殊要求。

1.2.2 PCR-Mass ARRAY联用高通量PCR技术 Mass ARRAY核心检测技术是基质辅助激光解吸电离(MALDI)飞行时间质谱。先通过基本的PCR反应原理对样本进行扩增，再采用碱基延伸法等获得产物，最后的检测对象是靶基因的延伸引物序列或者产物中通过酶切获得的核酸片段。待检产物经过MALDI的软电离技术的处理后，通过飞行时间质谱仪中的飞行时间对产物进行定性和定量[14]。Mass ARRAY不需借助标签而是直接对产物中的序列进行鉴别，检测更为直接，减少了假阳性率，且两大技术联用可以对PCR产物进行定性、定量，可用于病原体鉴别分型、基因突变检测等，功能十分强大。该技术也存在开盖操作的潜在污染风险问题，除此之外还有特殊的仪器设备需求。

1.3 多重PCR-基因测序联用技术 基因测序技术能够将待检样本的具体序列检测出来，已知序列和未知序列均可检测，是基因检测的金标准。随着基因测序技术的发展，通量和效益性不断提高，PCR产物采用基因测序的方式也是检测准确性和可靠性最高的方法之一。以Sanger脱氧测序法为主的第一代测序依赖PCR扩增，测序读长较长，准确度较好但成本高，检测周期偏长；第二代测序采用测序芯片法，极大提高了检测通量，降低了测序成本，但缺点是测序读长偏短；第三代测序为单分子DNA测序法，技术未完全成熟，但已经具备测序读长很长、可直接检测甲基化等表观修饰位点等优势[15]；第四代测序纳米测序法是融合纳米技术的创新性极高的一种测序方法，尚未发展成熟，很多环节尚处于实验室开发阶段[16, 17]。可以看出，第三代、第四代基因测序还在不断地发展和完善当中，发展较为成熟的第一代测序存在检测周期长成本较高的问题，二代测序也存在测序读长短的问题，所以基因测序技术要在临床广泛应用还需要一段时间。

2 闭管高通量PCR检测技术

闭管PCR检测技术在产物鉴定鉴别的过程中保持封闭状态，通过高分辨熔解曲线、荧光扩增曲线或熔解曲线分析技术等方法对产物进行鉴别。

2.1 单通道闭管检测PCR技术 单通道闭管PCR技术采用的是单一的荧光染料，通过芯片或者高分辨熔解曲线的方式对混合产物进行鉴别检测。

2.1.1 多重PCR高分辨率熔解曲线法 高分辨熔解曲线的原理在于同一段靶基因不同位点、不同数量的碱基差异会造成DNA解链的差异，使得双链特异性染料结合和分离的时间点不同，随之出现高分辨熔解率曲线形状上的差异[18]。高分辨率熔解曲线多用于基因突变、甲基化检测、基因位点多态性研究等。

多重PCR高分辨熔解曲线技术检测通量高，污染风险小，且借助曲线对产物性质和量的判断更为直观和简便且不需要特殊仪器，操作简单，经济效益高的同时保证了检测较好的敏感性和特异性[19]。但是，多重PCR高分辨熔解曲线技术对反应体系要求高，体系不合适时在数量较少的碱基突变检测中会出现错误结果，因此对实验设计要求很高。同时在碱基差异较小时，高分辨率熔解曲线上的差异十分细微，结果的准确性对实验人员的技术水准依赖性过大，具有漏诊和误诊的风险。

2.1.2 高通量PCR芯片法 PCR芯片法是一种将基因芯片技术和实时荧光定量PCR技术融合的高通量PCR技术，通常的PCR芯片是一种固相载体，所需引物固定在载体上，设立合适的定量PCR反应体系，样本将在微阵列上完成PCR扩增和定量。高通量PCR芯片的载体上有数百甚至上千种特异性引物，单张高通量PCR芯片就能完成数百种目的基因的检测，样本量较少时也能够完成检测[20]。PCR芯片应用范围广，可用于功能基因组研究、耐药性检测、病原微生物检测等。

PCR芯片将检测趋于集成化、耗时短、没有太多人员操作需求，兼具基因芯片的高特异性、高通量和实时荧光定量PCR的定量功能，有较好的发展前景。PCR芯片法虽然是在实时荧光定量PCR基础上建立的，但是这种集成化的PCR需要特殊仪器才能实现，在临床工作中若要得到普及，其集成化和自动化水平还需进一步优化。

2.2 多通道闭管检测PCR 多通道闭管检测PCR产物鉴别方法是主要是荧光扩增曲线或熔解曲线分析技术。荧光扩增曲线分析技术是利用不同标记荧光在多个通道定性或定量检测多个基因的技术，而荧光熔解曲线则是呈现波谷或者波峰的形态，通过判定波出现的位置来判断基因产物。随着不同探针和荧光染料的不断研发，荧光曲线分析法突破了传统PCR单通道的限制性。目前利用荧光熔解曲线法的PCR探针主要有双标记Taqman探针法、碱基猝灭探针法、双标记核肽酸探针法、分子信标等。

2.2.1 多通道闭管荧光扩增曲线分析法 荧光扩增曲线技术多重PCR技术是一种理论上非常适用于单管多通道多基因检测技术的方法。该技术通过分析探针在与存在差异的同一通道靶位点杂交和解离的温度差异来区分产物的。

2.2.2 多重PCR双标记自身猝灭Taqman探针法 双标记探针与传统的Taqman探针标记原理相似，在探针两端分别标记一个荧光基团和一个猝灭基团。不同于Taqman探针，这种双标记探针设计为在扩增过程中不被Taq酶剪切。双标记探针的猝灭基团和荧光基团在未与靶序列杂交时，通过两个基团相互靠近或者形成茎环结构造成荧光的减弱，而当探针和靶序列相互结合时，探针展开释放荧光信号。结合熔解曲线的原理，根据曲线波峰出现的温度位置判断产物类型[21]。双标记自身猝灭Taqman探针法在基因表达检测、基因分型、单核苷酸多态性检测等领域应用较多。

2.2.3 多重PCR碱基淬灭探针法 碱基淬灭探针法是由张俊等[22]提出和研发的仅需单标记的特殊探针。碱基淬灭探针在设计过程中，选择合适的末端碱基序列，后利用探针与模板结合时，核酸链和碱基对之间发生电子转移和电子传输，从而对探针末端的荧光标记产生淬灭作用的现象[23]。结合荧光熔解曲线分析法的原理，碱基淬灭探针法可以通过曲线波谷出现的温度位置对产物进行鉴别。碱基淬灭探针法目前主要应用于单核苷酸多态性、基因突变的检测。

2.2.4 多重PCR核肽酸双标记自身猝灭探针 核肽酸即PNA，是一种类多肽骨架的DNA类似物，具有与DNA或RNA特异性杂交，形成稳定的复合体的特点[24]。PNA作为杂交探针能够提高基因检测的特异性和灵敏度。

2.2.5 多重PCR分子信标法 分子信标是一种能够在5′和3′端存在一段互补序列并自身形成茎环结构的探针，由于两端各标有荧光基团和猝灭基团，故茎环结构时荧光猝灭。而在PCR反应开始后，随着温度的升高，分子信标杂交区域打开变成线型，与不序列结合时荧光增强程度不同，通过分析荧光熔解曲线的变化来鉴别产物，目前分子信标技术在微生物筛检分型应用较多[25]。

多通道闭管PCR技术采用的荧光熔解曲线法采用多种荧光通道，使得靶基因之间更容易鉴别，由于曲线呈现的是波或者谷的位置，在出现未知基因时更容易发现。但是由于探针设计和试验方法的不同，使得这种技术难以有统一的标准，加上部分荧光熔解曲线高通量PCR技术尚在研究阶段，体系优化还未达到最佳水平，各种探针法所得结果互相的参考价值不大。

闭管检测PCR主要利用荧光来鉴别产物，大大减少了产物污染导致假阳性结果的可能性。探针的不断改良推动了闭管检测PCR高通量的发展，但目前闭管检测还在不断地完善和研发中，还需要进一步优化才能实现真正意义上的生物安全性高、简便、快速和高通量。

3 小结

高通量PCR技术的成熟对临床工作意义重大，有助于临床以及流行病学的大规模高效、快速、准确、低成本的人群筛查的实现，也是推进个体化诊疗实现的一大助力。不同的高通量PCR技术有其独特的反应原理和反应体系，各有优劣。未来的高通量技术应当能够简便、快速、准确完成大批量多基因筛查，并完成基因分型、突变位点检测等等，同时还应当满足产物污染风险低，除PCR仪外，无需特殊仪器设备，最好是在闭管检测的环境中完成检测，能够产生较高的社会效益。相信随着科学技术和分子生物学的不断发展，高通量PCR的技术也会不断优化，在医学领域发挥更大的作用。