布鲁氏菌病实验室诊断方法的研究进展

高莎莎

布鲁氏菌病实验室诊断方法的研究进展

高莎莎

（河南省漯河市动物疫病预防控制中心 462000）

布鲁氏菌病(Brucellosis)，简称布病，也称马耳他热，是由布鲁氏菌属(Brucella)细菌引起的一种传染—变态反应性人畜共患传染病，OIE把该病列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。布鲁氏菌病病可感染多种动物和人，临床上主要引起母畜的流产病、公畜的睾丸炎，人感染主要表现为长期的发热、多汗、乏力、肌肉和关节疼等。近年来，我国布鲁氏菌病在人间和畜间的流行传播呈上升趋势，严重威胁着人们的健康和畜牧业生产。及时准确地诊断布鲁氏菌病对该病的防治和净化具有重要的现实意义，本文主要是结合布鲁氏菌病的危害，对布鲁氏菌病的病原学和免疫学实验室诊断方法进行概述，希望能为其他同行提供参考。

布鲁氏菌病 (Brucellosis)是由布鲁氏杆菌引起人和动物共患的慢性传染病。布鲁氏杆菌是一种革兰氏阴性、兼性胞内寄生菌。1886年，英国军医Bruce从一名因“马耳他热”死亡的士兵脾脏中分离确认，迄今已有百余年。根据布鲁氏菌的病原性和生化特性将该布病分为6个种20个生物型，包括3个羊布鲁氏菌(Br.melitensis)、9个牛种布鲁氏菌(Br.abortus)、5个猪布鲁氏菌(Br.suis)、1个绵羊附睾种布鲁氏菌(Br.ovis)、1个沙林鼠布鲁氏菌(Br.neotomae)、1个犬布鲁氏菌(Br.canis)[1]。另外，还发现了生物学特性有别于前面6种布鲁氏菌的海洋鲸型海洋种(Br.ceti)和鳍型海洋种(Br.pinnipedialis)[2]。

1 布鲁氏菌病的危害

（1）布鲁氏菌病可以感染多种动物和人，包括家畜、人和野生动物。但每种布鲁氏菌只对相应的动物具有最强的致病性，而对其他种类的动物致病性较弱或者缺乏致病性。发病及带菌动物是主要的传染源。患病动物的分泌物、排泄物、流产胎儿及乳汁等含有大量病菌，患病公畜精液中也含有病菌[1]。（2）在已知的6种布鲁氏菌中，牛种、羊种、猪种布鲁氏菌对人有较强的致病力和侵袭性，但以羊种布病感染最为严重。临床上母畜感染后主要表现为流产、死胎或者弱胎，通常只发生1次流产，第2胎多正常，主要是因为母畜感染布病后获得了免疫力。但有的母畜流产后会发生子宫炎或者脓肿导致生育能力下降，有的会发生关节炎导致跛行。公畜感染后多表现为睾丸炎和附睾炎，导致配种能力下降[1-3]。（3）人感染布鲁氏菌病主要是因为过多的接触患布病动物(如猪、牛、羊等)及其动物产品引起的。急性感染后常表现为发热、多汗、关节痛、神经痛及肝脾肿大，慢性感染则多表现为关节疼痛。目前，该病在世界各地均有不同程度的流行，给发生国家和地区造成了巨大的经济损失[1, 2, 4]。因此，提高布鲁氏菌病的实验室诊断水平，不断加强布鲁氏菌病的防控和净化，具有重要的现实意义。

2 布鲁氏菌病诊断技术

2.1 病原学诊断

病原学检测是诊断布鲁氏菌病的“金标准”。主要包括病料的采集、保存、分离培养和鉴定等。试验通常在无菌条件下取流产胎儿、胎盘、阴道分泌物或者乳汁，直接镜检或者接种于肝汤琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基等固体培养基，初代排样需要7~10d，等菌落长出后，再对菌落的形态特征、生化反应及染色特点进行判断。根据布鲁氏菌的菌落特征，可将其分为粗糙型布鲁氏菌和光滑型布鲁氏菌，其中光滑型占所有布鲁氏菌占绝大多数。光滑型布鲁氏菌菌落多呈露滴状，色微蓝，边缘整齐，有荧光，大小0.5~1.0mm。布鲁氏菌多用科兹洛夫斯基染色法染色，显微镜下为红色球状小杆菌，散在分布，偶见成对、短链或串状排列。最直接的方法的是从血液、体液、骨髓、关节积液检测到布鲁氏菌[1-2]。但由于病原的分离率低，加上培养时间长，常常影响该病的及时诊断，加上该病对实验室人员和环境要求较高，所以该方法不适合用于临床快速诊断。

2.2 免疫学诊断

血清学诊断方法是免疫学诊断方法中最常用的检测方法。包括虎红平板凝集试验(RBPT)、试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)、胶体金标试验(GICA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。还有专门用于检测乳用动物布病的全乳环状凝集试验(MRT)。

2.2.1 虎红平板凝集试验(RBPT) 虎红平板凝集试验是国际贸易中牛、羊、猪布鲁氏菌病检测的指定试验，在我国也用于人布鲁氏菌病监测的初筛。抗原是经培养灭活后，离心收集菌体用虎红染料染色后悬浮于乳酸缓冲液中制成。该方法灵敏度高，操作方便，检测快速且价格便宜，适于动物群体布鲁氏菌病的普查。

2.2.2 试管凝集试验(SAT) SAT是布病的确诊试验之一，虽然在发达国家已经停用，但是与RBPT相比，该方法准确性高，可以定量测定抗体水平，具有较高的特异性，能够识别IgM抗体，可以用于布病的早期诊断。需要注意的是，RBPT和SAT都属于凝集试验，而凝集实验的关键是识别布鲁氏菌LPS-O链抗原，而LPS-O链抗原是多种革兰氏阴性菌的共同抗原，因此SAT无法鉴别布鲁氏菌与其他革兰氏阴性菌存在的交叉感染[4]。该方法操作繁琐，反应时间长，也不适用于现场疫情快速诊断。

2.2.3 补体结合试验(CFT) 补体结合试验主要通过观察绵羊红细胞是否发生溶血来判断受检血清中有无待检抗体[5]。该方法灵敏性高，特异性强，对于牛、羊、绵羊附睾种布病的临床诊断具有较高的应用价值。特别是对于RBPT初筛阳性或者SAT诊断可疑的均可用CFT进行确诊。但是由于猪补体能够干扰豚鼠补体，导致实验敏感性下降38%左右，该方法不适用于猪布病诊断[5-8]。虽然该方法敏感性较高，但由于溶血素制备困难，试验操作繁琐，结果带有一定的主观性，难以在基层推广和现场检测。

2.2.4 胶体金标试验(GICA) （1）GICA是用胶体金作为示踪标记物，用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。朱明东[9]等人的研究证明，GICA操作简单，血清用量少，反应快速，可以用于布病的初筛、现场疫情快速诊断和流行病学调查等。（2）朱明东[10]还进行了GICA在布鲁氏菌病不同流行地区的现场应用效果的比较，结果发现GICA不仅可以及时快速发现患者，而且可以监测疫情，反映流行程度，具有较好的推广应用前景，对巩固布鲁氏菌病防治成果具有重要意义。程婷婷[11]建立的GICA方法，以40nm胶体金制备的试纸条敏感性最高，不仅能敏感、特异、简便、快速地检测布病，而且可鉴别布鲁氏菌自然感染和人工免疫，并可区分牛、羊种布鲁氏菌感染，可在基层推广使用。但是该方法只能定性诊断，不能实现定量测定，还存在质控指标还未统一、灵敏度需进一步提高等问题[12]。但是GICA目前还是有相当大的市场需求，特别是非免疫地区布病快速检测以及各个医院检验科。

2.2.5 酶联免疫吸附试验(ELISA) （1）ELISA是20世纪70年代发展起来的一种灵敏性高、特异性强的高效的抗体检测新技术。该方法操作方便，既可以作为确定诊断，又可以作为筛选和鉴别诊断。在布病检测中，只有牛布病ELISA是国际贸易指定的，用于其他布鲁氏菌病的ELISA还是研究的热点。该方法主要用于血清和乳样中的抗体检测[13]。（2）目前用于布病检测的ELISA有间接ELISA(iELISA)和竞争ELISA(cELISA)两种。ELISA首次用于布病检测是Carleson[14]用ELISA检测牛布病，发现ELISA的敏感性甚至比SAT高出1~100倍。目前布病ELISA试剂盒选用的抗原主要是LPS-S，而该抗原在LPS的O链上，但粗糙型布鲁氏菌缺乏O链，所以基于LPS-S抗原的检测方法无法检测到粗糙型布鲁氏菌产生的抗体。同时，虽然ELISA灵敏度高，特异性强，但并不能区分免疫接种产生的抗体还是自然感染产生的抗体。同时，还存在不能有效排除耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157感染动物的血清干扰，从而使ELISA方法的特异性受到一定程度影响。但仍然被OIE列为诊断牛布病的推荐方法[15, 16]。

2.2.6 全乳环状凝集试验(MRT) 全乳环状试验方法主要用于泌乳奶畜的布病初筛。MRT本质是抗原抗体反应，当乳汁中存在布病抗体时，红色的抗原抗体复合物就会转移至乳脂层，从而形成紫红色的乳脂环。该方法操作简便，反应时间短，避免了因采血难而带来的诸多弊端，可用于大规模奶牛筛查检测，大大提高了奶牛布病监测工作进度。但该方法不适用于检测患乳房炎及其他乳房疾病母牛的乳、初乳、脱脂乳和煮沸过的乳以及腐败、变酸和冻结的乳。

2.3 分子生物学诊断

分子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)、核酸探针检测、环介导等温扩增技术(LAMP)。

2.3.1 PCR检测 （1）PCR技术作为一种快速、准确、灵敏、高效的基因诊断技术已成为当前布鲁氏菌病分子生物学检测和病原学分型的重要手段。目前，普通PCR主要是通过检测编码布鲁氏菌BCSP-31序列和编码Omp外膜蛋白基因的原理[16]。但是单对的引物不能区分鉴别布鲁氏菌生物型。1990年，PCR在布病应用首次报道，从此应用分子生物学诊断布病迅速发展[17]。1994年，Bricker[18]建立了AMOS-PCR检测方法，是最早建立的布病多重PCR，实现在一个反应体系同时检出多种布鲁氏菌生物型，具有很好的使用价值。后经过改进，该方法鉴别菌种的类型进一步完善。钟旗[19]等人用该方法进行布病研究，发现AMOS-PCR的特异性、灵敏性均高于细菌分离和血清学诊断方法。叶勇刚[20]建立的奶牛布病PCR方法，可有效检出奶牛布鲁氏菌，且最低可检出1CFU的DNA.豆玲[21]建立的布鲁氏菌与炭疽菌的多重PCR方法，最低可检出345fg/uL的含量DNA。（2）荧光定量PCR是在PCR基础上发展起来的新技术，最大的优点就是通过捕捉实时荧光信号对扩增的布病核酸进行标量，直观的将结果呈现在电脑上。2000年，Redkar[22]用荧光标记引物探针，建立了可以特异性检测牛、羊、猪布鲁氏菌的RT-PCR方法。刘志国[23]等人建立的基于Taqman探针的多重荧光PCR实现了在快速检测布病的同时还能鉴别诊断是牛种还是羊种布病。目前，RT-PCR是最灵敏、最准确的检测样品中核酸含量的方法，该方法克服了PCR在平台期的误差，实现了核酸的准确定量，避免了电泳造成的污染和误差。但是该方法需要有特殊的设备，且成本较高，因此不适于在基层推广和现场检测[24-26]。

2.3.2 核酸探针检测 核酸探针技术是利用核苷酸严格配对原理发展起来的核酸探针杂交技术，是目前分子生物学中应用最广泛的技术之一。该方法灵敏度高，特异性好，操作简便，可以一次性检测大批量样本，适合用于临床样本检测和流行病学调查。由于核酸探针可以多次重复利用，大大降低了检测成本。王希良[27]等人制备的布鲁氏菌核酸探针检测布病，显示出很好的特异性和灵敏性，利用地高辛标记探针，建立的Dot-blot最低可检出5pg的核酸。Mater[28]制备的地高辛标记探针，完全可以用于血清学阳性和慢性病人血清的布鲁氏菌病的检测，并且具有较强的特异性。2000年，Fernández[29]用牛布鲁氏菌16S rRNA序列制备的3种核酸探针能够鉴别诊断了部分猪种布鲁氏菌与其他布鲁氏菌，显示出重要的应用价值。

2.3.3 环介导等温扩增技术(LAMP) 与PCR检测技术类似，LAMP也是通过特异性的扩增布鲁氏菌核苷酸序列对检测病原做出判断。潘文[30]等人建立了针对布鲁氏菌omp25基因的可视化LAMP检测方法，对S19株、S2、M5三株布鲁氏菌疫苗检测，结果显示出很好的扩增效果。许邹亮[31]等人建立的LAMP检测方法，最低可检出17fg的DNA，显示出良好的灵敏性。刘玉梅[32]用建立的LAMP和RT-PCR对10份布鲁氏菌病阳性血清的检测结果进行了比较，结果发现LAMP与RT-PCR有同样的灵敏度和特异性，且LAMP方法更快速、简便，经济，无需专用仪器设备，更适用于基层医院对布鲁氏菌的快速检测。赵志兵[33]建立的LAMP法，具有高度的特异性和灵敏性，对17种常见菌株的扩增结果为阴性，对S2、M5、104 M、55226四种布鲁氏菌疫苗株灵敏度分别达到5×10-4ng/μl、5×10-5ng/μl、5×10-3ng/μL和5×10-4ng/μl，并且在30min以内完成检测。该方法快速、灵敏、特异，有望成为快速检测布鲁氏菌的有效手段。 随着分子生物学技术的进步，新型的可视化LAMP方法表现出越来越多的优势，不仅对设备要求不高，而且容易操作，特别是肉眼可见的阳性结果，一步判定结果，降低了布病检测的危险性，适合在基层推广应用。

3 总结

综上所述，国内外布鲁氏菌病的实验室诊断方法较多，主要还是免疫学的RMBP、SAT、CFT、GICA、ELISA和MRT，以及分子生物学的PCR、核酸探针检测和LAMP，这些方法各有优点和不足，可以根据工作需要选择几种方法结合使用。目前，随着ELISA和分子生物学技术的快速发展，其灵敏性高、特异性强、操作简便等优势越来越凸显，逐渐成为布鲁氏菌病检测的重要手段。但开发特异、灵敏、能鉴别诊断自然感染与疫苗免疫的检测方法仍然是目前亟待解决的问题。

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（2019–06–01）

S855.1+2

A

1007-1733(2019)09-0069-05