沙蟾毒精抗肿瘤作用研究进展

阚钧，周瑞生，侯雪楠，白莎莎，黄海福，周岱翰，张恩欣

(1 广州中医药大学，广州 510405；2 广州中医药大学第一附属医院；3 广州中医药大学深圳医院)

中药来源于天然动植物，中医中药在抗肿瘤应用方面显示出了其独特的优势，多种中药提取物制成的中药制剂如华蟾素注射液、鸦胆子油乳、参芪扶正注射液等在临床抗肿瘤治疗中取得了很好的疗效。华蟾素注射液是以中华大蟾蜍的阴干全皮为主要原料，经水提醇沉工艺制备而成。蟾蜍这味中药在临床肿瘤治疗中应用已久，其分泌物蟾酥及干燥表皮蟾皮均可入药。经现代中药学成分分析，蟾酥及干蟾皮的化学成分主要有蟾蜍二烯羟酸内酯类、蟾毒色胺类及甾醇类化合物等[1]。沙蟾毒精是蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物中的一种主要活性单体成分，在蟾酥中含量达1.5%～2%，且表现出较强的抗肿瘤活性。有学者[2]对从蟾酥及蟾皮中分离得到的60余种蟾毒内酯类化合物进行抗肿瘤作用筛选，发现沙蟾毒精肿瘤抑制活性最显著，在肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中均具有很好的抗肿瘤活性，引起了越来越多国内外学者的关注。现将沙蟾毒精抗肿瘤作用研究进展综述如下。

1 沙蟾毒精的发现、提取及药代动力学

20世纪80年代，国内就有学者[3]发现蟾酥的某些成分具有抗肿瘤作用，同期也有国外学者对日本蟾蜍及越南蟾蜍进行化学成分研究，直至20世纪90年代国内才有关于中华大蟾蜍化学成分的文献[4]报道发表。1993年，日本学者[5]从蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物中分离出一种成分，将其命名为arenobufagin，并就其对心肌细胞钠-钾泵ATP酶的抑制作用进行了研究，结果发现arenobufagin具有一定的强心作用，对钠-钾泵ATP酶抑制效果是乌本苷的3.5倍。此时期国内有学者[6]继续进行蟾蜍化学成分的分离研究，并得到了更多的单体成分。2007年，国内学者[7]进一步分析发现，arenobufagin即为沙蟾毒精。

近年来，有研究[8]采用特征图谱法测定不同产地干蟾皮的沙蟾毒精的含量，结果表明四川产地蟾皮的沙蟾毒精含量较高(大花皮、中黑皮、超大皮、棕褐色皮、小黑皮质量分数分别是0.252 4%、0.158 4%、0.181 1%、0.125 8%、0.108 8%)，其次是江苏产地的黑皮(0.227 5%)，进一步表明沙蟾毒精在干蟾皮中具有较高的含量。李娟等[9]采用高效液相色谱-串联质谱法同时测定9种蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物，测得沙蟾毒精的含量为0.32～0.83 mg/g，为沙蟾毒精含量的测定提供了思路和方法。陈瀛澜等[10]发现，蟾酥鲜浆经不同方法(日晒干燥、50 ℃真空干燥、50 ℃鼓风干燥、80 ℃鼓风干燥、冷冻干燥)炮制加工，其含有沙蟾毒精的含量并未有明显差异，他们还指出50 ℃和80 ℃鼓风干燥所得蟾酥具有比其他干燥方法更强的肿瘤细胞抑制效果，但未说明产生不同抑制作用的具体成分。李晓龙等[11]进行蟾皮抗癌活性成分的正交分离纯化研究，首次发现了一种简单高效的3位磺酸化沙蟾毒精的合成和富集方法，并通过该方法对总蟾毒配基进行了磺酸化，实现了大量具有潜在抗癌活性化合物的合成和富集，为进一步实现高效低毒化合物的筛选提供了基础。韩玲玉等[12]对华蟾素注射液中化学成分进行研究，结果显示蟾蜍二烯羟酸内酯类为华蟾素注射液的主要抗肿瘤活性成分，其中分离得到的化合物中就有沙蟾毒精。陆国弟等[13]将沙蟾毒精与牛血清蛋白进行分子对接研究，结果发现沙蟾毒精能与小牛血清发生中等强度的结合，证实白蛋白是沙蟾毒精的载药蛋白。Feng等[14]进行沙蟾毒精药代动力学研究，发现沙蟾毒精的代谢稳定性优于其他报道的蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物，还观察到CYP3A5基因对沙蟾毒精羟基化具有偏好性，为阐明沙蟾毒精的Ⅰ期代谢提供了重要数据，有助于临床前药物的开发和合理使用。Yuan等[15]通过基于Mpeg-PLGA的纳米胶束系统作为沙蟾毒精的载体进行药代动力学研究，发现纳米胶束可能通过增加药物分子的细胞摄取增强了其抗癌作用，为进一步临床应用给药提供了依据。

2 沙蟾毒精的抗肿瘤作用

随着沙蟾毒精化学成分的进一步明确和提取工艺的不断改进，关于沙蟾毒精抗肿瘤活性的研究也日渐增多，近年来国内外学者纷纷对其抗肿瘤作用表现出了浓厚的兴趣。按照沙蟾毒精抗肿瘤作用机理不同大致可以分为三类，一是促进肿瘤细胞凋亡，二是抑制肿瘤侵袭和转移，三是抗肿瘤血管生成。

2.1 沙蟾毒精促进肿瘤细胞凋亡 关于沙蟾毒精抗肿瘤作用的研究最早见于2011年，曹惠慧等[16]的研究表明，沙蟾毒精具有良好的体内抗肿瘤活性，其可能通过活性氧自由基(ROS)、细胞内钙离子、MAPK和NF-κB信号通路调控肝癌细胞凋亡。随后有学者[17, 18]发现，沙蟾毒精可通过活化DNA修复酶PARP和自噬基因LC-3及下调mTOR表达，从而抑制HepG2/ADM裸鼠移植瘤的生长，证实沙蟾毒精可通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导肝癌细胞凋亡及自噬，从而发挥抗肝癌作用。党琳等[19]采用沙蟾毒精处理人肝癌SMMC-7721细胞，处理之后处于G2/M期细胞数量明显增加，Bax蛋白表达升高，bcl-2蛋白表达降低，推测沙蟾毒精可能通过线粒体凋亡途径诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡。Deng等[20]通过分子模拟等技术发现，沙蟾毒精可能通过ATM/ATR信号通路发挥细胞周期阻滞作用，从而达到促细胞凋亡效果。Xu等[21]通过构建结肠癌EGFP-SW480细胞裸鼠原位癌模型，观察到沙蟾毒精可以诱导Bax蛋白介导的细胞凋亡，从而抑制结肠癌细胞的生长，并通过细胞实验进一步证实沙蟾毒精是通过Bax-PGAM5L-Drp1复合物介导的内源性凋亡发挥抗结直肠癌的作用。Wang等[22]研究发现，沙蟾毒精可以诱导胰腺癌细胞G2/M周期阻滞，从而促进胰腺癌细胞的凋亡，还可以增强胰腺癌细胞对吉西他滨和5-氟尿嘧啶的敏感性。刘倩等[23]研究发现，沙蟾毒精可以促进肺癌PC-9细胞凋亡，并且发现这一效应可能是通过线粒体途径诱导的。还有研究[24]指出，沙蟾毒精可以引起非小细胞肺癌A549细胞及NCI-H460细胞发生凋亡，凋亡的发生可能与Noxa相关的信号通路激活有关。Li等[25]采用Hoechst33342荧光染色观察到，沙蟾毒精作用于非小细胞肺癌A549细胞后，边集的细胞不断增加，细胞核高度固缩、凝聚，出现凋亡小体；AnnexinV-PI双染结果显示，沙蟾毒精可以诱导A549细胞的凋亡，且呈剂量依赖性。Deng等[26]对沙蟾毒精诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡进行研究，结果表明沙蟾毒精在体内外都具有良好的抗乳腺癌活性，能够抑制乳腺癌移植瘤组织中肿瘤细胞的增殖活力，诱导肿瘤细胞凋亡，其可能发挥作用的机制是激活JNK通路、调控YAP磷酸化，最终导致乳腺癌细胞发生凋亡。Yue等[27]研究发现，沙蟾毒精可以诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡和G2/M周期阻滞。Lv等[28]通过对比沙蟾毒精及蟾毒灵对人食管鳞状细胞癌的抗癌效力，发现沙蟾毒精的抗癌作用更强，且对人正常食管鳞状细胞的毒性较低，表明沙蟾毒精在癌症和正常细胞之间具有很高的选择性，其发挥抗癌效力的机制可能为通过内源和外源途径激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)，通过增强caspase磷酸化激活P53信号传导，促进食管癌细胞凋亡，证明了沙蟾毒精对食管鳞状细胞癌的P53靶向治疗潜力。Han等[29]进行沙蟾毒精对人胶质母细胞瘤U-87细胞作用的相关研究，发现沙蟾毒精对癌性神经胶质细胞具有明显的促凋亡作用，且具有较高的选择性，其可能通过p38/MAPK信号通路发挥作用，并在大鼠的脑脊液中发现了沙蟾毒精，为沙蟾毒精在神经胶质母细胞瘤的应用提供了依据。

2.2 沙蟾毒精抑制肿瘤细胞侵袭和转移 目前国内外针对沙蟾毒精的抗肿瘤作用研究多集中在其促进肿瘤细胞凋亡方面，对抑制肿瘤侵袭和转移的研究相对较少。曹惠慧等[16]研究发现，沙蟾毒精可以抑制肝癌HepG2细胞的侵袭和转移。Wang等[22]研究也发现，沙蟾毒精可以下调磷酸化表皮生长因子受体水平，从而发挥抑制胰腺癌侵袭和转移的作用。Chen等[30]研究发现，沙蟾毒精通过下调β-catenin通路抑制上皮间质转化，从而抑制前列腺癌PC3细胞的侵袭和迁移，为沙蟾毒精作为转移性前列腺癌的治疗方法提供了依据。

2.3 沙蟾毒精抑制肿瘤血管生成 肿瘤细胞的生长依赖于周围血管的支持，抗肿瘤血管生成药物可以切断肿瘤细胞生长所需的氧气及其他营养物质，从而实现间接杀伤肿瘤细胞的作用。刘俊珊等[31]研究发现，沙蟾毒精具有明显的体内外抑制血管生成的作用，推测其抑制作用可能与诱导血管内皮细胞周期阻滞及凋亡有关。随后有研究[18]进一步指出，沙蟾毒精可以通过抑制VEGFR-2信号通路抑制血管内皮生长因子介导的血管生成。

3 沙蟾毒精临床应用需解决的问题

目前沙蟾毒精的抗肿瘤作用研究多集中在促肿瘤细胞凋亡方面，这可能与其具有杀伤肿瘤细胞的特性有关，但关于沙蟾毒精是否选择性杀伤肿瘤细胞的研究却并不充分，只有少数研究对比了沙蟾毒精对正常组织细胞的作用，论据的缺乏限制了沙蟾毒精的进一步临床应用。

沙蟾毒精的毒性作用及不良反应也是下一步临床应用需要解决的主要问题。有研究[32,33]表明，沙蟾毒精可能通过结合钠-钾泵ATP酶的α亚基对钠-钾泵产生抑制作用。进一步研究[34]表明，该机制可能会导致心肌细胞钙超载和能量紊乱，临床表现为超过一定剂量时产生心肌抑制导致传导阻滞和缓慢心律失常。如何控制沙蟾毒精应用剂量和减毒也是下一步研究的重点。Hou等[35,36]通过将抗肿瘤剂与ROS清除剂联合使用的策略，合成了6种沙蟾毒精的新型杂交品种，评价了它们对人肝癌细胞系HepG2细胞、阿霉素耐药亚系HepG2/ADM细胞和人心肌细胞系AC16细胞的体外细胞毒性，结果表明杂交品种对人心肌细胞系AC16细胞的细胞毒性有所减弱，为降低沙蟾毒精的心脏毒性提供了新的应用策略。

综上所述，沙蟾毒精这一中华大蟾蜍中提取的有效单体成分，其抗肿瘤作用已经得到了广泛关注，沙蟾毒精可通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞侵袭和转移、抑制肿瘤血管生成等途径发挥抗肿瘤作用。但是将其应用于临床，还有很长的路要走，进行其抗肿瘤机制的更深入研究、解决其给药剂量和降低毒副反应是未来研究的方向。