植入前遗传学检测技术在生殖医学领域的应用与挑战

黄荷凤 徐晨明 刘雪丽 施炜慧 叶木槿

全球首例植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing，PGT)试管婴儿诞生已近30年，作为产前诊断的替代治疗方法，PGT的发展可谓一日千里，对PGT结果正常的胎儿进行移植已造福许多家庭。PGT主要分为植入前遗传学非整倍体检测(PGT for aneuploidies，PGT-A)、染色体结构重排检测(PGT for chromosomal structural rearrangement，PGT-SR)和单基因病检测(PGT for monogenic/single gene defects，PGT-M)。现就近年来PGT在生殖医学领域中的应用与挑战进行综述。

1 活组织检查(简称活检)技术的应用与挑战

胚胎活检是PGT过程中获取遗传物质进行检测的关键步骤，其对胚胎本身发育潜能和出生子代健康的影响一直备受关注。采取何种活检方式、在何种时期进行活检仍存在争议。根据取材时间可分为卵母细胞的极体活检(polar body biopsy，PBB)、卵裂期胚胎的卵裂球活检(blastomere biopsy，BB)和囊胚期滋养层细胞活检(trophectoderm biopsy，TB)。PBB对胚胎损伤很小，伦理上更易被接受，第一极体和第二极体序贯活检可预测母源染色体整倍性和与疾病相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点。由于只能检测母方的遗传信息，PBB进行非整倍体筛查时可错漏高达40%的染色体异常[1]。由于无需等待胚胎发育到囊胚期，BB曾被广泛应用，但其弊端在于对胚胎的损伤大、可供检测的细胞数量少、准确度低、嵌合比例高，且卵裂期的胚胎普遍存在染色体不稳定(chromosome instability，CIN)现象。上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院一项多中心大规模队列研究[2]结果显示，卵裂期胚胎冻融造成的卵裂球丢失会引起胚胎植入率、临床妊娠率、继续妊娠率和活产率均降低。此外，已有研究[1]发现，相同的胚胎在卵裂期与囊胚期的活检结果存在差异，可能的解释为技术失误或胚胎发育伴随着自我修复。若胚胎自我修复为胚胎早期发育的常见现象，在其进行自我纠正之前进行活检可能会导致胚胎浪费。2000年初掀起了第一代基于荧光原位杂交(FISH)和BB的PGT-A或植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening，PGS)的热潮，直到著名的“Mastenbroek争论”表明其不会升高反而降低高龄女性的妊娠率，才一度推翻了PGS的有效性。其无效性的解释包括指征过泛、FISH只能检测5～7条染色体、卵裂期胚胎高度嵌合、技术人员经验不足等。在引入染色体全面筛查(comprehensive chromosome screening，CCS)和TB后，PGS 2.0重新进入了大众的视野。目前TB已逐渐取代了BB，活检滋养层细胞对胚胎损伤小，并且可一次检测多个细胞，其诊断结果更可靠，然而嵌合体胚胎的问题随之而来。有研究结果显示，TB样本含有20%～40%的嵌合比例，其大多数胚胎具有整倍体内细胞团(inner cell mass，ICM)。尽管TB检出的相对嵌合比例更低，但目前尚未确定滋养层细胞的核型反映ICM核型的程度。值得注意的是，一些非侵入性的检测技术为胚胎检测开辟了新方向。Magli等[3]发现，囊胚液里的DNA高度碎片化，推测为非整倍体细胞的凋亡产物，佐证了早期胚胎存在自我修复和对异常细胞的清除过程，故研究者认为可根据囊胚液扩增的结果评估胚胎质量。综上所述，胚胎活检对于胎儿的潜在伤害有待进一步研究，需要根据疾病的类型(染色体病或基因病)、疾病发生的分子机制(减数分裂或有丝分裂)选择最佳活检方式，与此同时，非侵入性检测技术是未来PGT发展的重要趋势。

2 检测和分析技术的应用与挑战

继PGS 1.0后，PGT-A检测已被新一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)和微阵列比较基因组杂交(array CGH，aCGH)技术所取代。NGS被广泛应用于针对染色体倒位、平衡易位、非平衡易位或罗伯逊易位等患者的PGT-SR中。另外，NGS能更好地检出微小拷贝数变异和嵌合体，以Illumina VeriSeq PGS为代表的高分辨NGS(high-resolution NGS，hr-NGS)对嵌合体的检出比aCGH更为敏感、准确，可检出嵌合比例为20%～80%的胚胎，但存在背景噪声与低比例嵌合难以区分的问题。不同遗传实验室在TB的嵌合体评价上无统一标准，过于严苛的评分标准可能使得有发育潜能的嵌合体胚胎归类为异常胚胎，导致胚胎浪费，反之则导致异常嵌合胚胎被移植而引起不良生殖结局。

等位基因脱扣(allele dropout，ADO)、等位基因优势扩增、扩增失败和DNA污染等是影响PGT-M准确诊断的重要因素。ADO指2个等位基因中的1个无法通过PCR扩增。当对致病基因(特别是复合杂合致病的基因)直接测序时，高频率ADO的发生将严重影响诊断结果。尤其在PGT-M过程中，由于活检细胞数量有限、DNA浓度低，全基因组扩增(whole genetic amplification，WGA)大大增加了ADO发生的可能。尽管目前基于多重置换扩增反应(multiple displacement amplification，MDA)的WGA具有较高的保真性和扩增效率，但ADO的发生仍不可避免。因此，建立能够发现潜在ADO的检测方法是避免PGT-M误诊的重要手段。

目前临床上主要通过同时检测致病基因及其两侧连锁的多态性标记，如SNP或短串联重复序列(short tandem repeat，STR)位点，即植入前遗传学单倍型分析(preimplantation genetic haplotyping,PGH)技术间接检测胚胎是否携带致病突变，以降低高比率ADO造成误诊的可能。其中检测涉及的STR或SNP位点往往需要针对不同的单基因疾病、不同的家庭单独开发设计，检测成本较高、耗时长。虽然新一代测序技术的发展降低了寻找SNP位点的难度和成本，但需要经验丰富的人员进行人工筛选提供信息的SNP位点(informative SNP)。且目前采用的策略是靶向捕获测序，而非基于全基因组的SNP单体型分析，可检测的单基因遗传病数量仍然受限。

近年来发展的Karyomapping技术是一种基于连锁分析技术、针对广泛的单基因遗传病的胚胎植入前检测方法。与直接突变检测和靶向单倍型分析相比，Karyomapping技术操作简单，并在保持检测结果准确的同时具有较好的灵活性，即无需对特定的患者和疾病设计相应的检测方案[4]。此外，Karyomapping检测所得的SNP位点覆盖整个基因组，可同时进行染色体变异检测，包括非整倍体和染色体大片段缺失等。然而无先证者、新发突变、生殖系嵌合或缺乏关键患病家族成员等情况发生时，将影响单倍型的构建，此时若进行PGT-M，则需在明确致病变异的前提下，通过精子单倍型检测或(和)PBB获取亲代的单体型信息。当夫妻双方为近亲结婚时，致病基因两侧的遗传学标记同源性高，将影响特异性DNA标记的筛选，从而限制了PGH技术的应用。

明确致病基因和基因变异的致病性是PGT-M开展的前提，随着基因检测技术的普及，更多的基因变异位点被检出，变异位点的致病性分析成为PGT-M检测前遗传咨询的重要内容。由于缺乏必要的证据支持，依据美国医学遗传学和基因组学学会(ACMG)变异分类指南[5]，一些未被疾病数据库收录的罕见类型变异将被分类为临床意义未明(VUS)变异，而这些变异往往需通过基因功能学实验或等待数据库更新、文献支持证据出现，才可能被重新归类为致病性或良性变异，成为或排除进行PGT的依据，而数据更新所需的漫长等待周期和不确定因素是目前携带VUS变异患者的最大困境。

3 移植胚胎的选择

嵌合体胚胎包含两种及以上核型的细胞，多源于胚胎发育早期减数分裂或有丝分裂错误，属于PGT-A除整倍体和非整倍体胚胎的第三类检测结果。有基于动物和人类研究结果证明，通过异常细胞凋亡、正常细胞倾向分布于内细胞团和有丝分裂时染色体异常的纠错机制等，嵌合体胚胎在植入前的发育会自我修复和选择。移植嵌合体胚胎后的活产报道[6]显示了嵌合体胚胎的发育潜能，由此人们开始重新思考嵌合体胚胎的临床管理策略。尽管如此，许多证据表明，与整倍体胚胎相比，嵌合体胚胎的植入率更低、流产率更高。胚胎在2细胞期就可出现嵌合，发展到卵裂期和囊胚期的胚胎嵌合比例分别为15%～90%和15%～30%[7]。胚胎嵌合的发生与女方年龄并不相关，其发生机制及其可能带来的影响尚不明确。因此，对于高龄、复发性流产或反复着床失败者进行的PGT-A检测，移植胚胎应优先选择正常的整倍体胚胎，若无其他可用胚胎，移植嵌合体胚胎前需告知咨询者存在潜在的流产或胎儿异常的风险。

尽管人们已广泛认识到卵裂期和囊胚期的胚胎嵌合现象，但是由于伦理、法律限制和研究材料的稀缺，有关嵌合体的研究主要局限于描述层面，缺乏功能上的验证，因此确定嵌合体的发病率、实际比例，以及量化嵌合胚胎的活力和发育潜能仍然是一项艰巨的任务。原则上，当无整倍体胚胎可用时，在遗传咨询时进行充分的风险告知并获得患者的知情同意后才可考虑嵌合体胚胎移植。国际胚胎植入前遗传学诊断协会(PGDIS)和孕前、胚胎移植前和产前基因诊断辩论协会(CoGEN)指南建议，采用hr-NGS平台对囊胚5～10个细胞进行检测，异常细胞>70%的胚胎不可移植，同时应避免移植可活产的13、18、21、22嵌合三体，与单亲二倍体有关的14、15嵌合三体，以及与宫内发育迟缓相关的2、7、16嵌合三体胚胎。

4 伦理的冲突与碰撞

以往的产前诊断并不针对迟发型遗传性疾病进行诊断，如成年型多囊肾病、Huntington舞蹈病等。随着PGT相关技术的迅猛发展和人们健康意识的提高，其适应证已由最初的染色体疾病和单基因疾病扩展到迟发型遗传病和人类白细胞抗原(HLA)配型(PGT for human leukocyte antigen，PGT-HLA)，前者主要包括癌症易感性疾病(如乳腺癌、卵巢癌等)、心脏疾病和神经退行性疾病等。随着临床应用范围的扩大，PGT不可避免地引发越来越多的伦理争议。虽然对于这类非早期发病或非100%发病的疾病开展PGT仍有争议，但越来越多的患者将在胚胎早期排除致病变异的PGT检测技术视为优先选择。因此，遗传咨询过程中，必须充分告知这类疾病的临床表型、疾病转归、易感风险、早期预防、PGT选择等方面的信息。此外，一些血液系统疾病或免疫缺陷疾病，如地中海贫血、高IgM综合征等，在进行常规PGT-M检测的同时可进行HLA配型，为前胎患儿提供干细胞移植供体，但常因获得PGT-M检测正常的胚胎少而使得获得HLA匹配的胚胎概率较低(常染色体隐性遗传病理论上得到HLA配型的胚胎概率为3/16，常染色体显性疾病为1/8)。若这类患者为高龄生育，需于遗传咨询时告知其存在较高的胚胎非整倍体异常风险。此外，如何对待不符合要求的胚胎和“救星胎儿”是否被“物化”等伦理问题都是值得探讨的。另外，全外显子测序前未告知次要发现(secondary findings)会触发一些伦理问题，ACMG推荐可报告59个可导致严重疾病如肿瘤、心血管疾病，以及可实施医疗干预的疾病基因变异。胎儿性别作为实施PGT过程中的常规次要发现，美国生殖医学会(ASRM)表示应告知患者这种可能性，但医师不可将胎儿性别作为生殖决策的影响因素。

5 结 语

PGT是人类生殖健康发展的一项革命性进展，通过高通量技术获得胚胎的基因组信息，选择最合适的胚胎移植入母体内，极大地提高了广大遗传病家庭生育健康子代的可能性，也为治疗特定遗传病同胞患者提供了新的途径。PGT的飞速发展必然会带来新的机遇与挑战，医师必须在“生殖自由、切勿伤害”的原则下作出生殖决策，这是PGT造福人类的基石。