Klotho 基因在认知功能障碍疾病中的临床意义及进展

刘鑫 崔春爱 黄学洙

1延边大学附属医院麻醉科（吉林延吉133000）；2延边大学医学院（吉林延吉133000）

Klotho 基因是一种与衰老相关的基因，于1997年被发现于具有衰老表型的小鼠体内，由KURO-O 等［1］学者以古希腊纺织生命之线的命运女神—Klotho 命名，简称为KL，当肾脏、心血管系统、内分泌与代谢系统出现疾病或有癌症发生时，Klotho 基因表达异常，会通过多种机制发挥抗衰老作用［2］。随着对KL 基因与脑功能关系的研究越来越多，发现外周注射的α-klotho 蛋白片段虽不能通过血脑屏障，但可诱导N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）蛋白GluN2B 的裂解，增强NMDAR 依赖的突触可塑性，以调控神经功能［3］。因此，了解KL 在大脑中的作用，对于帮助改善人类认知功能及其调控机制具有重要意义。

术后认知功能障碍（post operative cognitive dysfunction，POCD）是指患者自身认知功能良好，但经过麻醉或手术的患者在后期恢复阶段会发生几天或者几个月的认知功能障碍，偶见延长至术后几年甚至终身，严重影响了笔者术后的生存质量、职业及社会功能［4］。随着医学科技的不断进步，越来越多的老年患者接受手术治疗，而老年患者术后并发症的发生率较高，故POCD 的相关研究得到了麻醉界学者的关注。虽然KL 与POCD 相关性研究鲜有报道［5］，但是其发生机制尚不清楚，因此，了解KL 在大脑中的作用，对调控衰老、拮抗氧化应激及各种疾病导致的人类认知功能障碍以及脑外伤、术后并发症、神经退行性疾病的防治具有重要意义。本文就KL 基因的生物学活性与认知功能及神经系统之间的相关性研究作一简要综述。

1 KL 基因的生物学活性

运用小鼠限制性片段，筛选人肾脏cDNA 文库结果表明，人KL 基因cDNA 编码了一个含1 012 个氨基酸残基的蛋白，与小鼠有86%的同源性。人类及小鼠KL 基因定位于第13 号染色体（13q12），全长50 kb，含5 个外显子及4 个内含子，可通过mRNA 选择性剪切，产生两种转录因子，从而合成两种蛋白，即跨膜型KL 蛋白和分泌型KL 蛋白。

1.1 跨膜型KL（membrane bound Klotho） 属于I 型单通道跨膜蛋白，存在于细胞表面，130 kDa，具有非常短的细胞内结构域，没有功能结构域。KL 基因可编码而获得α-Klotho、β-Klotho、γ-Klotho 等一系列跨膜蛋白，其中α-Klotho 可表达在大脑等各种器官发挥多种生物学功能［6］，其中α-Klotho 目前被认为是一种抗衰老蛋白以及血清中的可溶性因子，可在脉络丛中表达，并释放到脑脊液［7］，可以增加突触和认知功能，影响中枢神经系统的成熟和衰老等相关的结构和功能。β-Klotho 是与β-葡萄糖醛酸苷酶相关的Ⅰ型膜蛋白，主要表达在肝脏和脂肪组织，参与代谢调节、葡萄糖摄取、胆汁酸合成和脂肪酸代谢。近期研究还表明，成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21，FGF21））通过FGFR1/β-klotho 通路上调过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ），而保护颅脑损伤后血脑屏障［8］，而γ-Klotho 与人膀胱癌的肿瘤侵袭和进展有关［9］。

跨膜型KL 蛋白主要由肾脏产生，在大脑中表达在脉络丛及神经元中［1］，作为成纤维细胞生长因子23（fibroblast growth factor 23，FGF23）的共受体，主要由骨原细胞和成骨细胞产生和分泌，N 端片段具有成纤维细胞生长因子受体结合位点；C 端片段具有KL 蛋白的结合位点［10］，从而达到控制矿物质离子及维生素D 在体内的稳定。跨膜型KL 蛋白可通过ADAM10 及ADAM17 金属蛋白酶，通过NMDAR 依赖机制被内化，导致神经元活性的增强和神经保护［11］；在体外，可通过胰岛素或低浓度钙离子的刺激促进KL 蛋白的脱落。

1.2 可溶型Klotho（soluble klotho，KL） 指跨膜型KL 的降解片段，广泛存在于血液、尿液和脑脊液中，发挥内分泌功能。血清sKL 水平与维持性血液透析患者心血管疾病的预后及2 型糖尿病的发病密切相关［12］。目前，对于体内KL 蛋白脱落的调控机制，尚未知晓。

1.3 分泌型KL（secreted Klotho） 通过mRNA 选择性剪切外显子3 产生的另一种稳定的蛋白，重70 kDa，脑组织中的含量是肾脏的十倍。据研究，分泌型KL 转录产物可在产生跨膜型KL 蛋白的相同器官上表达；但在记忆缺陷小鼠研究发现只有大脑可以产生分泌型KL 蛋白，具有抗衰老等神经保护作用［13］。目前，关于人类KL 功能的大多数研究都集中在跨膜蛋白及其对肾脏的保护作用，但分泌型KL 被认为是最主要的RNA 转录产物，并且是人类血清蛋白的主要存在形式［14］，然而分泌型KL 的功能有待于进一步揭晓。

2 KL 水平与氧化应激

年龄是中风发生和预后不良的最大独立危险因素，随着年龄的增长，氧化应激和炎症反应逐渐增加。大脑的免疫系统可以保护大脑不受来自自身物质和细胞自由流入大脑所造成的危害［15］，故也给研究KL 蛋白在大脑中的活动及外周组织中KL 对大脑的作用机制研究带来了难题。随着对小鼠的深入研究表明，KL 蛋白的表达水平与大脑和身体健康程度密切相关，这也为KL 作为人类健康和疾病的标志物研究提供了依据。人体血清中KL 水平与慢性应激、双相情感障碍（bipolar disorder，BP）等心理功能疾病有关［16-17］；KL 通过抑制肾缺血再灌注肾组织损伤的氧化应激，保护肾小管上皮细胞［18］；也可通过上调KL 水平，保护脑缺血导致的小鼠脑组织损伤［19］。SHARDELL 等［20］对833 例55 岁及以上年龄的志愿者检测结果表明，血浆KL浓度高于669 pg/mL（中位数）的参与者平均年龄较小，简易神经状态检查（MMSE）测量的认知评估得分较高，MMSE 在数年后显著下降的风险也越低，平均下降幅度也越小；较低KL 浓度的参与者以女性为主，与之前研究结果相符合，表明大脑中低水平的KL 与中枢神经系统疾病有关，而高水平的KL 有利于提高人类认知功能，保护中枢神经系统的健康。KL 蛋白可通过激活抗氧化酶系统，从而抑制海马中淀粉样蛋白的沉积，并且保护海马神经元受谷氨酸的毒性刺激。

此外，ZELDICH 等［21］还证实，分泌性KL 对暴露于谷氨酸和β-淀粉样蛋白的海马神经元具有神经保护作用。最近的研究也已证实，KL 被可溶性淀粉样前体蛋白激活，并与其相结合，保护中枢神经系统免受淀粉样蛋白的神经毒性作用。最近研究报道［22］，KL 可以抑制核转录因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的活性，减少炎性细胞因子TWEAK、TNF-α诱导的细胞黏附分子表达以及TGF-β诱导的肾纤维化，提示KL 与NF-κB p65 介导的炎症反应密切相关，但其调控机制尚不清楚。

3 KL 在中枢神经系统中的表达

KL 基因共含有400 多个单核苷酸多态性（single nucleotide Polymorphisms，SNPs），其中G395A 多态性影响了KL启动子转录因子结合。60 岁以下的人群没有表现出此多态性对认知功能的影响；但60 岁以上的会表现出较强的认知功能影响，且MMSE 得分更高；对90 岁以上的人群进行检测时发现G395A 多态性的认知功能受损较少，同时MMSE 评分也较高［23］。通过检测，研究人员发现KLVS 多态性是6个SNPs的集合，而6个SNPs处于完全连锁不平衡。最初KL-VS 杂合子个体在预期寿命期间均表现出更好的认知功能［24］，部分原因是因为前额叶背外侧的皮质体积增加［25］。然而，当使用年龄更大的受试群体时，却并未发现这种关联性，甚至KL-VS 会在男性痴呆患者或更严重的精神分裂症患者中出现。这表明KL 对认知的积极影响可能会受到时间、性别或其他与年龄相关疾病因素的限制，而这些因素及原因尚未阐明，均说明了KL 的多态性可能会改变大脑功能。

KL 在大脑中由脉络丛室管膜细胞、浦肯野细胞、海马神经元大量产生，也可在脑白质中检测到［26］。脉络丛是维持血脑屏障的重要结构，其基因表达谱显示更接近于肾脏组织，这也增加了KL 在脉络丛中发挥作用的可能性。在脉络丛中，KL 与Na 离子/K 离子-ATP 酶相互作用，从而调节Ca 离子稳态［27］。虽然KL 缺乏的小鼠脑脊液Ca 离子浓度变低，但并没有出现明显的脑脊液功能变化。KL 可能对脉络丛保持离子稳态具有影响，但脉络丛和小脑仍未被充分研究，具有较深的研究价值。前期研究表明，被敲除Klotho 基因的小鼠早期就表现出海马突触数量减少、轴突运输障碍和海马神经元变形、氧化应激及细胞凋亡标志物增加，导致神经元死亡，出现认知障碍［2］，并在8～12 周内死亡。相比之下过度表达KL 基因的小鼠具有明显更好的认知功能和记忆功能。近期研究也证实，KL 过度表达可以延长寿命之外，还可增强海马依赖性学习记忆功能，防止与衰老相关的认知能力下降［28-29］。DUBAL［29］等人证实，KL 可刺激GluN2B-NMDA 受体，从而使小鼠获得更好的认知功能和记忆功能。此外，KL 升高导致依赖NMDA 受体的基因增加，如Fos，这些基因增强了长时程增强效果，与学习和记忆功能有关。

虽然下丘脑-垂体-肾上腺（the hypothalamic-pituitaryadrenal axis，HPA）的中枢神经系统成分不表达KL［30］，但KL 缺陷小鼠却表现出HPA 功能障碍，表现为生长迟缓、性腺萎缩和不孕症。性腺萎缩和不育并不是由性器官中的KL 表达缺乏引起的，而是垂体产生性成熟所需的关键激素不足所造成。MISRAHI［31］指出成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1）是酪氨酸激酶受体，负责GnRH 神经元系统的形成，表明FGF21/FGFR1/Klotho B（KLB）信号通路介导对饥饿和其他代谢应激的反应。当前研究KL 会影响人类的认知功能，但其调控机制仍无法知晓。因此，目前主要研究关注点放在KL 在大脑的定位，从而帮助研究KL 的调控机制。

4 KL 与多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）

通过采集复发缓解型MS（relapsing-remitting multiple sclerosis，RRMS）患者和正常人群的脑脊液进行检测，结果显示RRMS 组脑脊液KL 含量明显低于对照组，此外KL浓度与扩充致残量表评分呈明显负相关，而KL 浓度与脑脊液中铁还原抗氧化能力（ferric reducing anti-oxidant power，FRAP）测定呈显著正相关［32］。多巴胺能神经元对于衰老过程特别敏感，是大多数神经退行性疾病发展过程中丧失的关键细胞群［33］。随着年龄的增长，KL 表达缺陷的小鼠表现出多巴胺能神经元及其神经递质多巴胺的选择性丧失，可通过降低维生素D 的水平而改善。在神经退行性疾病模型中显示出，当KL 增加时，多巴胺能神经元的丧失、运动和认知功能均得到保护［34-35］。然而RRMS 患者血清KL 浓度却较正常人群高，尤其是病程较长患者，或许是对神经再生或维生素D 的一种补偿反应。跨模型KL 被裂解释放到血液，从而维持维生素D-FGF23-KL 蛋白内分泌轴，以补偿MS 患者维生素D 水平不足。

5 KL 与术后认知功能障碍

术后认知功能障碍是指接受全麻下手术的患者，在术后出现的中枢神经系统的并发症，表现出不同程度认知上的障碍。通常在麻醉与手术之后具有记忆受损、人格改变、精神焦虑、语言表达能力减退等表现。这些症状与AD患者的前期症状相似。

本课题组的前期研究表明，七氟烷麻醉以及手术均对成年SD 大鼠早期认知功能产生一定的影响，而对远期学习记忆能力没有或者影响甚微，POCD 与大鼠血清KL 蛋白变化存在一定的相关性［36］。小剂量丙泊酚对成年大鼠KL蛋白和认知功能无影响；大剂量丙泊酚会引起成年大鼠麻醉后第1 天Klotho 蛋白明显下降，同时引起认知功能障碍，远期则无影响；POCD 的发生可能与Klotho 蛋白含量的降低有关［5］。腹腔镜下胆囊切除术的患者30 例，有10 例在术后第1 天发生POCD，其POCD 发生率为33.3%；与术前基础值相比较，术后第1 天MMSE 评分下降（P＜0.05）［5］。前期研究发现KL 与氧化应激诱导的POCD 密切相关［5］，KL 通过降低NF-κBp65 活性抑制炎性介质的释放，且KL显著抑制巨噬细胞聚集，进而减少诱发活性氧相关酶，如iNOS、NOS，从而减少氧化应激，拮抗POCD 的发展。因此，可以通过探讨Klotho 对脑内免疫细胞及巨噬细胞侵润的信号通路调控，阐明KL 与POCD 的相关性，将为POCD 的发生机制提供新的思路。

6 问题与展望

许多研究都已经证明，KL 在大脑中高度表达，具有改善认知功能及神经保护作用，同时KL 在神经元活动中起到了至关重要的作用。

从临床角度看，尽管仍然不确定KL 抑制衰老的机制，但通过刺激内源性KL 的产生来提高KL 水平或运用外源性KL 蛋白片段诱导并增强NMDA 依赖性突触可塑性［37］，或许是减缓衰老过程，预防年龄相关疾病发生的潜在治疗靶点；尽管已经有研究证实POCD 的发生可能与KL 蛋白有关，然而KL 蛋白所调节的信号通路及其分子机制尚未可知，可以成为未来研究方向，从而为POCD 的防治提供理论依据；KL 的水平或许可以用作判断认知功能及神经退行性程度的生物标志物，而这也为一些神经系统疾病的治疗提供了新的思路。