咳特灵片胶囊总黄酮含量和抗氧化活性研究

丁天宇 黄慧学 陈贻威

[摘要]目的 对22批咳特灵片（胶囊）总黄酮含量和抗氧化活性进行研究，探讨咳特灵片（胶囊）总黄酮体外抗氧化活性。方法 以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法在510 nm对22（包括1批次过期品）批咳特灵片（胶囊）进行总黄酮含量测定;并以维生素C作为对比，以DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、Fe3+还原能力作为指标，对咳特灵片（胶囊）进行体外抗氧化活性的测定。结果 21批有效期内咳特灵片剂和胶囊的平均总黄酮含量、DPPH自由基、ABTS自由基清除率和Fe3+还原能力分别为12.57%、10.13%、77.44%、83.27%、54.51%、49.93%、0.15、0.13，均有清除DPPH自由基、ABTS自由基作用及对Fe3+的还原能力。结论 咳特灵片（胶囊）在一定浓度范围内具有较强的抗氧化活性。

[关键词]咳特灵;体外抗氧化活性;总黄酮;片剂;胶囊

[中图分类号] R284.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）12（b）-0009-04

[Abstract] Objective To investigate the in vitro antioxidant activity of total flavonoids from Keteling Tablets （Capsules） by a study on total flavonoid content and antioxidant activity of 22 batches of Keteling Tablets （Capsules）. Methods Taking rutin as the reference substance， the total flavonoid content of 22 batches （including 1 batch of expired products） of Keteling Tablets （Capsules） was determined by ultraviolet spectrophotometry at 510 nm. Vitamin C was used as a comparison， DPPH free radical scavenging ability， ABTS free radical scavenging ability， and Fe3+ reducing ability were taken as indicators to determine the in vitro antioxidant activity of Keteling Tablets （Capsules）. Results The average total flavonoid content， DPPH free radical scavenging rate， ABTS free radical scavenging rate and Fe3+ reducing ability of the 21 batches of Keteling Tablets and Capsules within the expiration date were 12.57%， 10.13%， 77.44%， 83.27%， 54.51%， 49.93%， 0.15， and 0.13， respectively， all showing ability of scavenging DPPH free radicals and ABTS free radicals and the ability to reduce Fe3+. Conclusion Keteling Tablets （Capsules） have strong antioxidant activity in a certain concentration range.

[Key words] Keteling; In vitro antioxidant activity; Total flavonoids; Tablets; Capsules

咳特灵片（胶囊）是中西药复方制剂，由小叶榕干浸膏和马来酸氯苯那敏组成，具有镇咳平喘、消炎祛痰的功效，常用于治疗咳喘及慢性支气管炎[1]。小叶榕叶为桑科植物细叶榕Ficus microcarpa L.f.干燥叶的提取物，在岭南地区民间多用于治疗咳嗽、痢疾、小儿夜啼等[2]。小叶榕干浸膏含有荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷等多种黄酮类成分[3]。当呼吸道受到异物刺激时容易引发咳嗽，咳嗽在清除呼吸道异物时从而引发炎症。现代药理学研究表明[3]，咳嗽是慢性支气管炎的重要临床特征，镇咳祛痰和增加人体内抗氧化能力，对治疗慢性支气管炎具有良好的效果。氧化损伤与人体内疾病如呼吸道疾病、心血管疾病等多种其他疾病的发生密切相关[4]，因此，本研究对咳特灵片（胶囊）总黄酮抗氧化活性进行探讨，以期为咳特灵片（胶囊）治疗慢性支气管炎深入研究奠定科学基础。

1仪器与材料

1.1仪器

Infinite M200 PRO全波长多功能酶标仪（瑞士Tecan）;SQP型电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）;SB25-12D型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2材料

芦丁（批号：MVST-19010202），购自中国科学院成都生物研究所;维生素C（Vc），购于国药集团化学试剂有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐均购于麦克林公司;氢氧化钠、三氯化铁、铁氰化钾均购于成都金山化学试剂有限公司;乙醇购于成都市科隆化学品有限公司;甲醇、三氯醋酸购于天津市大茂化學试剂有限公司;22批咳特灵片（胶囊），其中片（P）（广西厂家P1～5，广东厂家P6～9，包括1批过期的广东厂家P10），胶囊（J）（广东厂家J1～9，江西厂家J10，吉林厂家J11～12）。

2方法与结果

2.1总黄酮含量测定

2.1.1芦丁对照品溶液的制备  取芦丁对照品5 mg，精密称定，置于25 ml容量瓶中，加无水乙醇适量，超声使溶解，放冷，加无水乙醇至刻度，摇匀，即得到210 μg/ml的芦丁对照品溶液，冷藏，备用。

2.1.2供试品溶液的制备  取咳特灵片20片，除去包衣后研细，精密称取1.5 g;取咳特灵胶囊，将内容物混匀，精密称取1.4 g，置于50 ml容量瓶中，加70%甲醇适量，密塞，超声45 min使其溶解，放冷，用70%甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3线性关系考察  精密量取芦丁对照品溶液1、2、3、4、5、6 ml分别置于25 ml容量瓶中，各加纯水至6 ml，加5%亚硝酸钠1 ml，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝1 ml，摇匀，放置6 min，加入4%氢氧化钠10 ml，加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白对照。用酶标仪于510 nm处测定吸光度（OD）[5]。

2.1.4样品总黄酮含量测定  将咳特灵片（胶囊）分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下样品测定方法测定A值并计算总黄酮含量。

2.2体外抗氧化活性研究

2.2.1咳特灵DPPH清除能力的测定  0.1 mmol/L DPPH溶液的配置：精密称取4 mg的DPPH，用无水乙醇定容至100 ml，4℃避光保存。

按“2.1.2”项下方法制备样品溶液，用70%甲醇将样品制成质量浓度0.0112 mg/ml的供试品溶液，取2 ml不同浓度的样品溶液，加2 ml现配的0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光放置30 min，以无水乙醇为空白在517 nm下测定其OD（A1）。2 ml的无水乙醇代替DPPH溶液，其余操作同上为空白（A2）。2 ml的无水乙醇代替样品溶液，其余操作同上为空白（A0），Vc为阳性对照。根据以下公式计算咳特灵对DPPH自由基的消除能力：清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100%[6-9]。

2.2.2去除ABTS自由基能力的测定  ABTS反应液：精密称取0.3841 g ABTS用超纯水定容至100 ml，配制成7 mmol/L的ABTS溶液，精密称取0.0662 g过硫酸钾用超纯水定容至100 ml，配制成2.45 mmol/L过硫酸钾水溶液。将100 ml 7 mmol/L的ABTS溶液与2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液混合，避光静置16 h，得到ABTS反应液，取1 ml ABTS反应液加入100 ml无水乙醇，用无水乙醇逐级稀释该溶液至吸光值为0.70±0.02。

将3.9 ml ABTS反应液分别加入100 μl不同浓度的咳特灵溶液（A样品）或乙醇溶液（A空白）在避光条件下反应30 min，在734 nm下测定其吸光值，根据以下公式计算去除ABTS自由基能力：清除率（%）=[（A空白-A样品）/A空白]×100%[10-12]。

2.2.3对Fe3+还原能力的测定  2.5 ml的磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.6）+2.5 ml K3Fe（CN）6（1%）。将1 ml不同浓度的咳特灵溶液分别加入反应体系内，50℃水浴20 min。后加入2.5 ml 10%三氯醋酸，1000 r/min离心10 min。取上清夜2.5 ml加入到2.5 ml蒸馏水和0.5 ml 0.1%的FeC13体系中。反应10 min，在700 nm下测吸光值[13-16]。

2.2.4统计学方法  实验数据用Excel 2016、Graph pad 8软件进行分析，采用One way Anova进行差异性分析，以P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异显著。

2.3结果

2.3.1检测波长的选择  按“2.1.1”和“2.1.2”项下制备样品溶液和对照品溶液，在波长300～500 nm范围内进行波长扫描，样品溶液和对照品溶液在510 nm处有最大吸收，故选择检测波长为510 nm。

2.3.2线性范围  以OD（A）为纵坐标，芦丁质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。计算回归方程为A=11.545C-0.0169。结果表明，芦丁在8.40～50.40 μg/ml内线性关系良好，r2=0.9994。

2.3.3总黄酮含量的测定  广东厂家咳特灵胶囊和片剂中总黄酮平均质量分数分别为11.45%和12.28%，广西厂家咳特灵片剂中总黄酮平均质量分数为12.80%，21批有效期内咳特灵片剂和胶囊的平均总黄酮含量分别为12.57%、10.13%，具体结果见表1。

2.3.4咳特灵片（胶囊）对DPPH自由基的清除能力  由表1可知，21批有效期内咳特灵片剂和胶囊的DPPH自由基自由基清除率分别为77.44%、83.27%，除过期咳特灵片剂P10外，不同厂家的咳特灵片和胶囊对DPPH自由基均有良好的清除作用。

2.3.5咳特灵片（胶囊）对ABTS自由基的清除能力  21批有效期内咳特灵片剂和胶囊的ABTS自由基自由基清除率分别为54.51%、49.93%，咳特灵片（胶囊）质量浓度为0.09、0.18、0.36 mg/ml时抗氧化活性均低于Vc，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）（表2）。提示不同厂家的咳特灵片（胶囊）对ABTS自由基均有良好的清除作用，且对ABTS自由基清除能力随着药液浓度的增加而增强。

2.3.6咳特灵片（胶囊）对Fe3+的还原能力  FRAP法测定总还原力，通过抗氧化剂将Fe3+还原为Fe2+，使蓝色铁离子络合物的色泽消褪，通过在593 nm下测定其OD，通过测定其OD的变化，可以反映其还原能力的大小。咳特灵片（胶囊）的总还原力随著样品浓度的增大OD逐渐升高，即在实验浓度范围内，抗氧化能力随着质量浓度的增加而增加，且相同浓度时抗氧化能力低于Vc（图1）。21批有效期内咳特灵片剂和胶囊的Fe3+的还原能力分别为0.15、0.13。

3讨论

3.1咳特灵片（胶囊）总黄酮含量

通过对4个省22批咳特灵片和胶囊总黄酮含量的测定，结果提示，广东咳特灵胶囊厂家较多且总黄酮含量相对其他地区较高，广西咳特灵片总黄酮含量相对广东较高;过期的咳特灵片剂总黄酮含量最低。

3.2咳特灵片（胶囊）的抗氧化活性

抗氧化实验结果提示，21批咳特灵片（胶囊）对ABTS自由基、DPPH自由基均具有一定的清除作用，且具有较强的还原力。在实验浓度范围内，咳特灵片（胶囊）去除DPPH和ABTS自由基的能力及总还原力随着质量浓度的增加而增加，21批咳特灵中有15批DPPH自由基清除率超过80%，咳特灵片（胶囊）质量浓度为0.09、0.18、0.36 mg/ml时抗氧化活性与阳性组比较有显著性差异，不同厂家的咳特灵片（胶囊）对ABTS自由基均有良好的清除作用，且对ABTS自由基清除能力随着药液浓度的增加而增强;其质量浓度为0.18 mg/ml时，对Fe3+还原能力较强。

综上所述，咳特灵片（胶囊）在一定浓度范围，随着含量的增加，抗氧化活性增强。

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（收稿日期：2019-05-07  本文编辑：任秀兰）