替芬泰对HepG2A64细胞基因水平表达的影响

孙梁琨 冉娜 胡琦兰

[摘要]目的 探討替芬泰对HepG2 A64细胞基因水平表达的影响。方法 选取HepG2 A64耐药细胞株作为研究对象，根据有无使用替芬泰将其分为观察组与对照组，观察组采用抗乙型肝炎病毒（HBV）效果较好的剂量122.5 μg替芬泰，对照组除不加替芬泰外，其余处理同观察组。应用基因芯片的方法，检测并分析两组HepG2 A64细胞中的基因表达水平。结果 实验结果提示，观察组细胞与对照组细胞比较，许多基因的表达出现相应的上调或下调，编码基因中表达差异10倍以上的基因有11个，分别为：ZNF503反义RNA 1（ZNF503-AS1）、丝氨酸肽酶抑制剂Kazal 4型（SPINK4）、白介素21受体（IL-21R）、钙与整合素结合家族成员4（CIB4）、糖蛋白NMB（跨膜）（GPNMB）、CELF2反义RNA 2（CELF2-AS2）、酸性磷酸酶5（ACP5）、含有7B的kelch域（KLHDC7B）、突触结合蛋白4（SYT4）、MRPL23反义RNA 1（MRPL23-AS1）、智人H19印迹母系表达的转录本（H19），其中IL-21R与免疫相关;把差异表达倍数在1.5倍以上的基因取出，应用KEGG通路分析，有9个，分别为：层粘连蛋白β3（LAMB3）、肿瘤坏死因子（TNF）、周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（p21）、B细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤2（Bcl2）、周期蛋白依赖激酶6（CDK6）、转录激活因子4（CERB）、蛋白激酶C（PKC）、蛋白酪氨酸激酶2（Pyk2）、小鼠骨肉瘤病毒致癌基因同源（FOS），参与HBV感染相关分子调节网络，从而通过干预胞内信号通路钙依赖性酪氨酸激酶-2（Calcium-Pyk2）传导发挥体外抗HBV作用。结论 替芬泰可通过调控HBV复制下游Calcium-Pyk2信号通路和p21因子，从而对HBx蛋白的功能产生影响，达到抑制HBV复制的作用，并可通过影响细胞IL-21、Bcl2等免疫因子，提高细胞抗HBV作用。

[关键词]替芬泰片;HepG2 A64细胞;基因水平;表达

[中图分类号] R322.47          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）12（b）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of Tifentail on gene expression in HepG2 A64 cells. Methods HepG2 A64 drug-resistant cell line was selected as the research object. In the observation group， 122.5 μg Tifentai （the dose with better anti-hepatitis B virus [HBV] effect） was used， and another blank control group was used. The control group was treated the same as the observation group except for the absence of Tifentail. Gene chip was used to detect and analyze gene expression in two groups of HepG2 A64 cells. Results The results showed that compared with the control group， the expression of many genes in the observation group was up-regulated or down-regulated， and there were eleven genes with the expression difference of more than 10 times in the coding genes， ZNF503 antisense RNA 1 （ZNF503-AS1）， serine peptidase inhibitor Kazal type 4 （SPINK4）， interleukin 21 receptor （IL-21R）， calcium and integrin binding family member 4 （CIB4）， glycoprotein （transmembrane） NMB （GPNMB）， CELF2 antisense RNA 2 （CELF2-AS2）， acid phosphatase 5 （ACP5）， kelch domain containing 7B （KLHDC7B）， synaptotagmin Ⅳ （SYT4）， MRPL23 antisense RNA 1 （MRPL23-AS1）， homo sapiens H19 imprinted maternally expressed transcript （H19） respectively. Among them， IL-21R was associated with immunity. The genes with differentially expressed multiples of 1.5 times or more were extracted and analyzed by KEGG pathway， laminin β3 （LAMB3）， tumor necrosis factor （TNF）， cyclin-dependent kinase inhibitor 1A （p21）， B-cell CLL/lymphoma 2 （Bcl2）， cyclin-dependent kinase 6 （CDK6）， activating transcription factor 4 （CERB）， protein kinase C γ （PKC）， protein tyrosine kinase 2 β （Pyk2）， murine osteosarcoma viral oncogene homolog （FOS） respectively. They were involved in the molecular regulatory network related to HBV infection， and thus play an anti-HBV role in vitro by interfering with intracellular signaling pathway calcium-dependent proline-rich tyrosine kinase-2 （Calcium-Pyk2） conduction. Conclusion Tifentail can inhibit HBV replication by regulating Calcium-Pyk2 signaling pathway and p21 factor downstream of HBV replication， and enhance the anti-HBV effect of cells by influencing immune factors such as IL-21 and Bcl2.

[Key words] Tefentail Tablets; HepG2 A64 cells; Gene level; Expression

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是引起乙型肝炎（简称乙肝）的病原体[1]，全世界约有20多亿人正在感染过或者感染过HBV，慢性乙型肝炎患者己超过4亿人。我国的HBV感染率较高，全国感染过HBV的有50%～70%，其中慢性乙肝患者约有60%[2]。因此，降低HBV的感染率、加快对乙型肝炎的临床治疗和新药研发已刻不容缓。近年来，我国的中草药马蹄金（贵州苗药，旋花科，别名黄疽草，在广西、四川又称“小金钱草”）在治疗乙型肝炎上得到了很好地利用，马蹄金主治急、慢性肝炎、黄疽型肝炎、胆囊炎等症[3]。而从马蹄金中分离得到的替芬泰是具有抗乙肝病毒活性的单体马蹄金素的衍生物，抗HBV的活性强[4]。

在替芬泰作用机制的研究初期，筆者对HBV复制环节的几个关键靶点进行研究。通过研究发现，首先替芬泰对HBV聚合酶并没有明显的抑制活性，表明替芬泰的抗病毒机制不同于核苷（酸）类似物。其次，笔者从病毒复制环节并未找到替芬泰抑制HBV DNA的作用靶点，推测替芬泰可能诱导宿主免疫反应达到抗病毒的作用，并且作用于病毒宿主相互作用的多个靶点。于是笔者从细胞整体水平进行研究，选用HepG2 A64耐药细胞株作为研究对象，应用基因芯片的方法，通过宿主自身的功能调节寻找其抗HBV的作用位点。本研究将考察替芬泰对HepG2 A64细胞基因水平表达的影响，旨在寻找替芬泰抗HBV的作用位点，为抗HBV药品研发提供更多参考依据，现报道如下。

1对象与方法

1.1研究对象

HepG2A64细胞：拉米夫定和恩替卡韦都可产生耐药的细胞系（突变位点：rtL180M+rtM204V+ rtT184L），由解放军第302医院肝衰竭中心构建并进行传代培养。

1.2主要仪器与试剂

1.2.1药物  替芬泰，纯度99%，由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室合成，批号：20140106。

1.2.2试剂  DMEM培养液（美国Coring公司，批号：10-013-CVR）;胎牛血清（美国Gibco公司，批号：10099-141-500ML）;胰蛋白酶（Amresco公司，批号：Amresco-0785-1G）;EDTA（Amresco公司，批号：Amresco-177）;Trizol（美国ambion，批号：invitrogen 15596-026）;DMSO（Vetec公司，批号：V900090）;0.22 μm无菌滤器（sartorius stedim公司，批号：17575-K 25MM）。

1.2.3主要仪器  CCL-170B-8型二氧化碳培养箱（新加坡ESCO公司）;CKX53型倒置显微镜（日本Olympus公司）;CellBIND型细胞培养瓶（美国Coring公司）;COSTAR型6孔细胞培养板（美国Coring公司）;sorvall lynx 4000型低温高速离心机（美国Thermo公司）;XB4200C型电子分析天平（上海天平仪器厂）;BSC-1800IIB2型生物安全柜（北京东联哈尔）;DW-86W100J型超低温冰箱（海尔集团）。

1.3实验分组及处理

将采用122.5 μg（抗HBV效果较好的剂量）替芬泰的细胞作为观察组，另设对照组，对照组除不加替芬泰外，其余处理同观察组。

观察组：将122.5 μg替芬泰分别加入6孔细胞培养板中，1.0 ml/孔，每个浓度3孔，放5% CO2、37℃细胞培养箱。给药第3天，更换原浓度替芬泰药液，给药第6天，收取细胞上清，细胞用除RNA酶的PBS溶液洗涤3次，每孔加入1 ml Trizol裂解，裂解液用RNA提取试剂盒提取细胞内总RNA。

1.4观察指标及检测方法

1.4.1观察指标

将观察组与对照组进行比较，观察两组HepG2 A64细胞中，基因水平表达差异10倍、1.5倍的情况。

1.4.2观察指标的检测方法

1.4.2.1细胞培养  选用对数生长期的A64细胞，用0.02%的EDTA洗两遍，加入0.25%胰蛋白酶1 ml，静置消化3～5 min，轻轻吹散细胞成单个状态，计数到2×105个细胞/ml，接种至6孔细胞培养板中，1.0 ml/孔。放入5% CO2、37℃细胞培养箱培养，待细胞贴壁后进行实验。

1.4.2.2基因表达的检测  样品总RNA送上海欧易生物医学科技有限公司，利用NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific）定量并经Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）检测RNA完整性。RNA质检合格后，样本的标记、芯片的杂交以及洗脱参照芯片标准流程。首先，总RNA反转录成双链cDNA，再进一步合成用Cyanine-3-CTP（Cy3）标记的cRNA。标记好的cRNA和芯片杂交，洗脱后利用Agilent Scanner G2505C（Agilent Technologies）扫描，得到原始图像。

1.5统计学方法

采用Feature Extraction软件（version10.7.1.1，Agilent Technologies）处理原始图像，提取原始数据。接着利用Genespring软件（version 12.5，Agilent Technologies）进行quantile标准化和后续处理。标准化后的数据进行过滤，在用于比较的每组样本中至少有一组100%标记为Detected的探针留下进行后续分析。利用t检验的P值和倍数变化值进行差异基因筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥2.0且P值≤0.05。接着，对差异基因进行GO和KEGG富集分析，以判定差异基因主要影响的生物学功能或者通路。最后，对差异基因进行非监督层次聚类，利用热图的形式展示差异基因在不同样本间的表达模式。

2结果

2.1观察组与对照组细胞基因表达水平的比较

实验结果提示，观察组细胞与对照组细胞的基因表达水平比较，许多基因的表达出现相应的上调或下调，编码基因中表达差异10倍以上的基因有11个（表1），表达上调的基因中，免疫相关基因有白介素-21受体（IL-21R）基因。

2.2替芬泰处理HepG2 A64细胞差异表达1.5倍以上的基因

由于替芬泰抗HBV的作用较为温和，本研究把差异表达倍数在1.5倍以上的基因全部取出，应用KEGG通路分析，发现替芬泰处理细胞后有9个差异表达倍数在1.5倍以上的胞内小分子蛋白参与HBV感染相关分子调节网络，从而通过干预胞内信号通路传导发挥体外抗HBV作用，见表2、图1、图2。

3讨论

替芬泰是马蹄金素的衍生物，其在乙肝病毒试验筛选的结果显示较强的抗HBV活性[5]。为了深入研究替芬泰抗HBV作用机制，本研究进行了体内外抗HBV试验的深入研究，结果有所发现。

本研究结果提示，观察组细胞与对照组细胞比较，许多基因的表达出现相应的上调或下调，编码基因中表达差异10倍以上的基因有11个。而梁光义[6]的研究结果也显示，替芬泰对HepG2 A64具有抗HBV的作用。由于替芬泰抗HBV的作用较为温和，本研究把差异表达倍数在1.5倍以上的基因全部取出，应用KEGG通路分析，发现替芬泰处理细胞后有9个差异表达倍数在1.5倍以上的胞内小分子蛋白参与HBV感染相关分子调节网络，从而通过干预胞内信号通路传导发挥体外抗HBV作用。表达上调10倍以上的基因有5种，下调10倍以上的基因有6种。表达上调的基因中免疫相关基因有IL-21R基因。IL-21R很有可能与替芬泰的抗病毒机制有关[7]。郑春新[8]的研究也表明，IL-21R信号通路可抑制肝癌生长。近期的一项研究显示，急性HBV感染患者血液中HBcAg特异的分泌IL-21的CD4+T细胞比慢性HBV感染患者多，提示乙型肝炎核心抗原（HBcAg）特异的分泌IL-21的CD4+T细胞对于控制HBV感染起到一定的作用[9];上调的p21分子，抑制早期细胞周期检测点去调节作用使细胞增殖速率减缓;Bcl2基因编码26KD的膜结合蛋白，可结合于线粒体外膜、滑面内质网及核膜上，抑制由多种刺激信号引起的凋亡。Bcl2可能作用于Fas的信号传导途径，阻止Bax插入到线粒体膜上和由Bax引起的细胞色素C的释放。但Bcl2抑制凋亡的确切机制仍不明确[10]。Bcl2在正常肝细胞中并不表达，仅在部分肝肿瘤中可被检测到。由于Fas在肝脏细胞中呈持续表达，故Bcl2可保护肝癌细胞，包括DNA受损的细胞逃脱Fas介导的凋亡。因此，Bcl2可能涉及肝癌发生的某些机制，如通过下调细胞膜上的Fas表达量来发挥其抑制凋亡的作用，但具体机制有待进一步研究[11]。钙依赖性酪氨酸激酶-2（calcium-dependent proline-rich tyrosine kinase-2，Calcium-Pyk2）信号通路是目前明确可影响HBV复制的环节之一。研究证实HBx蛋白促使该信号通路中Pyk2及FAK的磷酸化，下调Src激酶通路，促进HBV DNA的复制，但这一过程可被线粒体钙通道阻滞剂环胞素A（Cyclosporin A，CsA）和胞浆钙抑制剂BAPTA-AM所逆转，并下调HBV DNA在胞内复制及病毒抗原的分泌[12-15]。

综上所述，经替芬泰处理细胞基因表达水平出现相应的上调或下调，表达差异大，可由表达谱基因芯片结果推测替芬泰可通过调控HBV复制下游Calcium-Pyk2信号通路和p21因子，从而对HBx蛋白的功能产生影响，达到抑制HBV复制的作用;并可通过影响细胞IL-21、Bcl-2等免疫因子提高细胞抗HBV作用。

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（收稿日期：2019-04-04  本文编辑：孟庆卿）