AFP、AFP－L3、GP73及DCP蛋白在老年肝癌患者中的表达分析及临床意义

张岩 邓黎黎 张壮苗 颜榕辛

（三亚市人民医院肿瘤内科，海南 三亚572000）

肝癌是老年患者中最常见恶性肿瘤，也是我国发病率最高、危害最大恶性肿瘤之一［1－2］。随着现代生产和生活方式改变，肝癌发病率和死亡率有逐年升高趋势。关于肝癌发病机理尚不明确，已有证据显示其可能与肝炎病毒感染、家族遗传、过度饮酒、肝硬化等因素相关［3］。肝癌患者早期并无典型临床症状，因此诊断时患者通常处于中晚期。目前临床上尚无特效肝癌治疗手段，患者预后较差。因此，探索肝癌发病相关生物大分子标志物，加强早期诊断准确性对临床实践具有重要价值。甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）是胎儿肝脏中合成糖蛋白，但成年人体内含量通常下降到极低水平［4］；甲胎蛋白异质体（AFP－L3）、高尔基体跨膜蛋白73（GP73）和异常凝血酶原（DCP）也是体内与多种恶性肿瘤病理过程相关生物大分子［5－6］，但是目前尚未见到其与老年肝癌患者发病及预后相关性报道。本研究对AFP、AFP－L3，GP73及DCP 蛋白在老年肝癌患者中表达及其与预后相关性进行研究，为临床治疗提供参考。报告如下。

1 资料与方法

1.1 临 床 资 料 对 本 院2011 年01 月 至2016 年12月期间诊治老年肝癌患者进行研究。60例患者中男38例，女22例，年龄57～69岁，平均（64.6±6．7）岁。所有患者均符合中国抗癌协会肝癌专业委员会颁布《肝癌规范化诊疗2011版》中关于肝癌诊断标准，并经病理学确认。以本院同期老年肝硬化患者（n＝60）为对照。各组研究对象在平均年龄、性别比例等一般资料方面差异无统计学意义（P＞0．05）。排除标准：严重心肾功能异常患者；严重代谢功能障碍患者；严重认知功能障碍患者；高血压患者；严重糖尿病患者。所有患者均知情并签署知情同意书，并经医院伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器 AFP 蛋白检测试剂盒购自Abcam 公司；AFP－L3蛋白检测试剂盒购自Omega公司；DCP蛋白检测试剂盒购自R＆D 公司；GP73蛋白检测试剂盒购自Elabsciences公司；二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；96孔酶标板购自美国Costar公司；全波长酶标仪购自美国Bio－Rad公司；低温冷冻离心机购自贝克曼库尔特公司；低温冰箱购自三菱集团；移液器购自赛多利斯公司；枪头购自Thermo Fisher公司。

1.3 免疫组织化学法 肿瘤组织取出后立即用福尔马林固定，待用。石蜡固定后进行5μm 组织切片，分析不同组织中AFP 及AFP－L3定位及表达。5μm 石蜡切片经过二甲苯脱蜡和梯度乙醇水合（100%、95%、90%、80%、70%）后 将 切 片置 于 枸 橼酸三钠：枸橼酸＝3∶4溶液中用微波进行修复（设置中高火，时间8min），3%双氧水－甲醇溶液处理切片15min进行封闭灭活酶，加一抗（1∶250）37 ℃，湿盒孵育2小时，加HRP标记二抗（1∶250）孵育1 h，苏木精复染细胞核，封片，光学显微镜观察、拍照。

1.4 酶联免疫吸附测定法 抽取各组研究对象清晨空腹静脉血后1 000转／min低速离心，分离上层血清，－80 ℃保存待用。建立标准曲线：设标准孔，每个孔中加入样本稀释液100μL，第一个孔加标准品100μL，混匀后用加样器取出100μL 移至第二孔，重复操作至第7孔，最后从第7孔中吸出100μL丢弃，使其最终体积为100μL；加样：待测样本孔每个孔加入待测样本100μL；将反应板充分混匀后置37 ℃2h；洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤5次，倒置于滤纸上印干；每个孔中加入第一抗体工作液50μL；将反应板置于37 ℃条件下60min；洗板；每个孔中加入酶标抗体工作液100μL；将反应板置于37 ℃条件下60min；洗板；每个孔中加入底物工作液100μL，置于37 ℃暗处条件下反应5～10min；每个孔加入终止液50μL；在450nm 处测定各孔光吸收值，计算相应浓度。

1.5 回访 根据患者临床资料以电话形式对所有老年肝癌组患者进行回访，生存期以患者接受首次治疗时间为起点，计算单位为月，截止日期为2017年1月，截尾值为到截止日期存活患者。

1.6 统计学方法 数据统计采用SPSS19．0软件进行分析，计数资料用（±s）表示，多样本比较用单因素方差分析，用Kaplan－Meier分析AFP、AFPL3、DCP和GP73与生存期之间相关性，Long－rank法筛选对肝癌预后有影响因素，并绘制Kaplan－Meier曲线。P＜0．05差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 AFP、AFP－L3蛋白在老年肝癌患者中表达分析 研究发现与对照组老年肝硬化组患者相比，老年肝癌患者组血清中AFP 及AFP－L3蛋白表达明显升高，且差异存在显著统计学意义（P＜0．05）。见表1。

表1 AFP、AFP－L3蛋白在老年肝癌患者中表达分析

2.2 GP73及DCP蛋白在老年肝癌患者中表达分析 研究发现与对照组老年肝硬化组患者相比，老年肝癌患者组血清中GP73及DCP 蛋白表达明显升高，差异有显著统计学意义（P＜0．05），见表2。

表2 GP73及DCP蛋白在老年肝癌患者中表达分析

2.3 AFP、AFP－L3蛋白在肝癌组织中定位及表达分析 免疫组织化学检测AFP、AFP－L3蛋白在肝癌组织中定位及表达结果发现，与对照组老年肝硬化组患者相比，老年肝癌患者组织中AFP 及AFPL3蛋白表达（棕色部分）明显升高。见图1。

2.4 AFP、AFP－L3与老年肝癌患者预后相关性分析 在对AFP、AFP－L3与老年肝癌患者预后相关性进行分析时发现随着AFP、AFP－L3蛋白表达升高，患者预后逐渐变差。见图2。

图2 AFP、AFP－L3与老年肝癌患者预后相关性分析

2.5 DCP和GP73与老年肝癌患者预后相关性分析 在对DCP 和GP73与老年肝癌患者预后相关性进行分析时发现随着DCP 和GP73蛋白表达升高，患者预后逐渐变差，见图3。

图3 DCP和GP73与老年肝癌患者预后相关性分析

3 讨 论

恶性肿瘤已成为威胁老年人健康重要疾病，老年病人多脏器功能差、合并症多，并发恶性肿瘤后多预后差，死亡率高。如何能在老年人当中早期筛查出恶性肿瘤，并对早期患者进行早期干预和治疗，从而达到提高疗效，延长生存期目，乃是我们目前迫在眉睫需要解决问题。本研究通过拿老年肝硬化组和老年肝癌组做对照，分析肝癌发病相关肿瘤标记物AFP、AFP－L3、GP73和DCP 蛋白在两组患者中表达及其与预后相关性研究，以望能对临床老年肝癌早期诊断和治疗提供指导意义。

AFP其在胚胎时期由胎肝合成，出生后血清中AFP含量即显著下降，一年内达到正常成人水平（＜20ng／mL），而在PHC 发生时则又会急剧上升，是目前公认最好肝癌临床检查指标。甲胎蛋白异质体（AFP－L3）是PHC患者血清中AFP主要形式。AFP－L3因包含α1－6岩藻糖残基，连接N－乙酰葡萄糖胺还原端后与LCA（扁豆凝集素）紧密结合，仅由肝癌细胞产生。本研究发现与对照组老年肝硬化组患者相比，老年肝癌患者组血清中AFP、AFP－L3蛋白表达明显升高，且差异存在显著统计学意义（见表1），王军海等［7］研究中也有相似发现，同时该研究还发现AFP－L3与肿瘤大小密切相关。通过免疫组织化学，在肝癌组织中确实可以定位到AFP、AFP－L3蛋白表达，且其表达量要显著高于对照组老年肝硬化组患者。

GP73是感染病毒后肝细胞内具有正调节作用固有高尔基蛋白。GP73 主要由胆管上皮细胞表达，无论何种原因引起肝病，患者GP73水平均显著上调，而所有肝病患者中肝癌患者GP73 水平最高［8］。本研究中，老年肝癌患者组血清中GP73 蛋白表达较对照组老年肝硬化组患者明显升高。王文鼎等［9］研究中比较了肝癌、肝硬化和健康人体内血清GP73水平，发现肝癌患者血清中GP73 高达（201.9±92.9）μg／L 显著高于肝硬化患者（76．4±25.5）μg／L 和正常人（29．9±15．0）μg／L。DCP 是一种由于维生素K 缺乏或Ⅱ型拮抗所产生异常蛋白，其氨基末端缺乏Y 一氨基谷氨酸，因而无法像正常凝血酶原一样与钙离子结合［10］。老年肝癌患者组血清中GP73及DCP 蛋白表达较对照组老年肝硬化组患者明显升高。有研究者认为肝癌患者血清中DCP过表达可能机制是肝癌细胞微粒体内维生素K 依赖羧化体系功能障碍，羧化酶活力下降，导致羧化不全，从而形成大量DCP，DCP 对PHC有较高特异性，各种非癌性肝病，继发性肝癌及良性肝脏肿瘤假阳性极低［11］。GP73 和DCP 在多种恶性肿瘤组织内呈现高表达，且与多种恶性肿瘤病理过程密切相关，对其研究可以有利于发现肝癌发病机制，早诊断早干预［12－13］。

以往研究还发现血清GP73和AFP 等十项肿瘤标志物联合诊断HBsAg阳性肝癌具有较好准确性［14］，且肿瘤标志物DCP 和AFP 在原发性肝癌 诊断中具有重要价值［15］。李慧等［16］也发现GP73联合其他肿瘤标志物检测对AFP 阴性原发性肝细胞癌患者临床诊断参考意义重大，且肝癌患者血清中GP73与肿瘤组织中JAK－STAT 通路激活密切相关［17］卢凌鹏等［18］也证实血清GP73、DCP和VEGF检测可协助AFP诊断原发性肝癌，联合4种标志物检测可显著提高原发性肝癌检出率。本研究中，通过对AFP、AFP－L3、GP73及DCP蛋白表达与患者预后之间关系分析显示，随着AFP、AFP－L3、GP73及DCP蛋白表达升高，患者预后逐渐变差。本研究联合检测AFP、AFP－L3、GP73 及DCP4 种肿瘤标记物在老年肝癌患者中表达，每一种血清肿瘤标记物都有其独特优势，联合多种血清标记物可以通过优势互补，有效且准确诊断早期肝癌发展方向。

综上所述，PHC 发生是一个多因素参与、多步骤复杂过程，AFP、AFP－L3、GP73及DCP蛋白表达可以作为鉴别良恶性肿瘤参考标准，4种肿瘤标记物高表达患者发生肝癌可能性较大，而高表达患者预后较差。对联合检测上述指标，可以提高肝癌患者早期检出率，从而对肝癌早期诊断和早期治疗具有重要临床和实践价值。