基于生信分析赵琦教授对三仁汤主药治疗结直肠腺瘤的预测研究

郭伟鑫 赵琦 王秀琳 梁江 黄曜勇 杨梅 刘立莉

（1．贵州中医药大学，贵州 贵阳550025；2．贵州中医药大学笫二附属医院，贵州 贵阳550001）

大肠息肉是所有向肠腔突出的赘生物总称。大肠息肉可分为腺瘤息肉与非腺瘤息肉，而研究表明结直肠腺瘤发展与结肠癌密切相关。多数研究认为息肉的发生与肠隐窝中的肠道干细抱的异常克隆和增殖分化有关［1］。结直肠腺瘤患者往往有大便变形、大便稀溏、大便习惯改变的临床表现。以寒湿气候、饮食偏辛辣的云贵地区，赵琦教授认为腺瘤的发生发展与中医湿聚痰凝，聚而成块机理相似，临床使用三仁汤主药（苦杏仁、薏苡仁、半夏）治疗结肠息肉患者能改善其临床症状。但目前缺乏实验证据其作用机制，本研究拟从该方核心药物及相关干预基因、CRA 患者与正常人黏膜组织差异基因取交集，通过生物信息分析，理论上探索该方治疗CRT 潜在基因靶点，为后续靶点实验提供理论研究。报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究资料 CRA 患者与正常人黏膜组织差异基因数据集的获取在公共基因GEO 数据库（即GeneExpression Omnibus，http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／geo／）数据库中下载CRA 患者与常人黏膜组织对比研究4块芯片数据（见表1）。将获取的数据导入GCBI自带实验室分析软件，按照其生物信息分析模块构建路线图（见图1）进行自动运算分析，获得4 套芯片中CRA 患者与常人差异基因后取交集①（其中差异分析Q＜0．05，差异倍数1.2，若各条芯片中差异基因＜10，则取并集）。

图1 生物信息分析路线图

1.2 三仁汤中主药潜在靶基因数据集的获取 以苦杏仁、薏苡仁、半夏为主题词在BATMAN—TcM（a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，http：／／bionet．ncpsb．org／batman－tcm／）、 TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，http：／／lsp．nwu．edu．cn）检索3味药物化学成分及对应调节基因，各自删除重复项后取交集。苦杏仁、薏苡仁、半夏分别有113.38．116个化学成分，对应的靶点基因分别为296、131、386个。取交集后得出化学成分2个（亚麻酸、油酸），得出靶基因数据集②共有115个。

1.3 分析方法 将数据集①②取交集后得到3个靶点基因分别为MYC、HNF4A、GCG，将这3 个靶基 因 代 入STRING （functional protein associa－tion networks，https：／／string－db．org，http：／／bionet．ncpsb．org）对其功能、生物过程进行GO 分析（Gene Ontology，表2），信号通路富集KEGG 分析（表3），以及参与生物功能的蛋白相互作用网络分析（MCODE分析），以上分析取前15条，不足15条者展示所有条目。

2 结 果

2.1 CRA 患者与正常人黏膜组织差异基因数据集 在GEO 数据集检测见表1。

表1 CRA 患者与正常人黏膜组织差异基因研究芯片

对原始芯片数据，首先进行芯片信号值的预处理与预过滤，然后使用差异分析方法SAM 法，05次对所纳入的1．套芯片数据进G 差异基因的筛选。差异基因的筛选条件为P＜0．05，差异倍数≥1.5倍，其中从GSE37364中获得差异基因8 956个，有3 744个表达上调，5 212个表达下调；从GSE77953中获得差异基因5 833个，2 878个表达上调，2 955个表达下调；从GSE81804 中获得差异基因1 044个，有321 个 表 达 上 调，723 个 表 达 下 调；从GSE50592中获得差异基因5 574个，3 120个表达上调，2 454个表达下调；4块基因芯片差异基因取交集后得到246个，进行后续的生物信息学分析。

2.2 ①②数据集交集基因生信分析结果

表2 生物过程GO 分析结果

表3 KEGG 通路分析结果

2.3 MCODE分析结果 ①②数据集交集后得到MYC、HNF4A、GCG 3个基因，经扩张相关基因范围后，MCODE 分析结果如下图（图2，圆圈表示基因，连线表示关联性，连线越多表示作用越紧密，箭头所指为下游基因，相反则为上游基因），通过后期文献回顾，我们发现MYC、HNF4A、GCG 参与各种癌症、肿瘤过程，其中MYC、HNF4A 关系密切，这3个基因同时为TP53上游基因，TP53为明星基因，参与多种癌症及肿瘤的发生发展，这3个通过同时参与调节TP53，以TP53为枢纽参与结直肠癌通路形成过程。见图2。

图2 MCODE分析网络图

3 讨 论

CRA 当属于中医学“肠瘤”、“泄泻”、“积聚”等范畴，王庆其等［2］认为结肠腺瘤由痰、瘀、湿、毒积聚久而成积形成。在湿寒气候的贵州西南地区CRA患者以大便稀溏、大便习惯及形状改变等作为主要临床症状，且CRA 为结肠癌前期阶段。赵琦教授以“疾病一病因一病机一方药”为思想，认为结直肠腺瘤主要病机为痰湿凝聚成块，病位在肠，发病与脾相关；用三仁汤中杏仁、半夏、薏苡仁为核心药物，根据临床兼证及舌脉象加减相关中药治疗该证。三仁汤特点为宣中焦、降肺气。其中半夏性温，归脾胃肺经，有燥湿化痰，消痞散结，降逆止呕之效，更有学者［3］通过实验证明半夏成分中凝集素可以抑制结肠癌细胞增殖生长，那么半夏其他成分能否抑制结直肠黏膜异常增生值得探索；薏苡仁性甘淡微寒，归脾胃肺大肠经，有清热利湿，除风湿，利水消肿，益肺健脾之效，有学者［4－5］分别通过实验的方法证实薏苡仁脂可以抑制结肠癌细胞增殖及诱导细胞凋亡，薏苡仁油可治疗结直肠癌术后患者，提高免疫力及降低相关肿瘤标志物；杏仁性温，归肺大肠经，有降肺气、祛痰润肠之效，有学者［6］实验证明苦杏仁中所含蛋白同样可以抑制结肠在细胞增分裂且具有浓度依赖性。赵琦教授以三仁汤针对本病从湿论治，以健脾化湿，降气化痰为治则往往奏效，虽此方药临床效果不错，但针对CRA 组织作用效果与靶点仍未探明。课题组已在前期研究中用生信分析的方法验证了中药对骨关节炎的靶基因预测［7］，本研究拟用相同方法进行三仁汤主药对CRA 的靶点预测。

CRA 目前公认是结肠癌的发展前期，提出“腺瘤一癌序列”学说，Shussmant N 等［8］认为腺瘤一癌序列的形成是基因改变的累积结果。多数研究认为腺瘤与肠道干细胞的过分增殖克隆分化相关，细胞增殖分裂速度超过细胞的凋亡速度从而使肠干细胞在隐窝底部不断累积，最后突出肠腔形成腺瘤，这与中医痰湿凝聚成块病机相似。GEO 数据库拥有目前大量关于CRA 基因芯片数据，这使我们尝试寻找治疗该病的靶基因成为可能。我们尝试①②交集获得相同对应的靶点基因，得到MYC、HNF4A、GCG 3个潜在靶基因，我们通过对这3个靶基因扩展相关基因范围后进行生物信息分析，生物过程GO 富集发现它们参与了生物高分子、细胞、基因表达正调节代谢过程，这符合上述的腺瘤形成与肠道干细胞异常分裂、增殖相关。KEGG 通路分析发现3个靶点基因与各种癌症、肿瘤形成相关，其中以MYC 为枢纽与结肠癌形成密切相关，而结肠癌公认与CRA 的发生发展密切联系，其中MYC与HNF4A 联系紧密，同时存在于中药成分亚麻酸中，后期经文献溯源发现原癌基因MYC 通过改变癌发生的腺瘤阶段的代谢过程，MYC 的异常表达改变结直肠黏膜细胞代谢重编程而导致腺瘤、癌的发生发展，Satoh K 等［9］发现抑制MYC靶标嘧啶合成基因如CAD，UMPS和CTPS等基因从而抑制细胞生长，因此MYC 是治疗结直肠腺瘤、癌的潜在靶基因。有研究发现MYC、HNF4A 可能参与了细胞生长、周期调节和有丝分裂，影响疾病进展［10］。M Darsigny等［11］研究发现HNF4A 是在肠道肿瘤发生过程中根除异常上皮细胞对ROS产生抗性的潜在治疗靶点。有学者［12］通过本研究相同的方法，发现同正常黏膜基因表达水平相比，GCG 成下调趋势，可以作为“腺瘤一癌序列”预后和疾病发展的观察指标。另外MYC、HNF4A、GCG 并不是CRA 的孤立靶基因，经过分子功能GO 分析，它们均具有蛋白结合功能，参与CRA 形成过程，通过MCODE 网络分析，它们以TP53为枢纽参与了结直肠腺瘤一癌序列过程。

综上，通过生物信息分析及文献溯源，我们得知MYC、HNF4A 参与了CRA 细胞生长、周期调节等过程，GCG 可作为CRA 疾病发展的观察指标，3个潜在靶基因以蛋白结合，以MYC 为枢纽、核心靶点参与了CRA 与结直肠癌形成过程，以上阐述杏仁、薏苡仁、半夏治疗CRA 潜在机制，为后续实验研究提供方向。受赵琦教授“疾病—病因—病机—方药”思想和现代药理学家通过药物成分及结构推知药理作用启发，本研究通过数据库将CRA 患者与正常人黏膜组织差异基因群、三仁汤中具体中药成分干预疾病基因群取交集后进行GO、KEGG、网络分析等生物信息分析，找到具体中药治疗CRA潜在基因靶点具有积极意义。然而此研究仍存在一些不足，第一从GEO 数据库纳入芯片数据较少，无法涵盖所有CRA 患者与常人黏膜组织所有差异基因数据；第二从BATMAN、TCMSP收录的杏仁、半夏、薏苡仁对应的药物成分及调节基因也有可能出现遗漏；第三获得的潜在靶基因及相关蛋白人体内受影响是多方面的，差异度大并不意味与CRA进展与疗效直接相关。这三点促使我们有必要在细胞或动物实验中进行验证与探索。