红树莓提取物对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化及NF－κB／VCAM －1通路的影响

钱银芬 罗红阳 钱伟 付茂蓉 曹磊 罗瑞 杨永曜

（1．贵州省乌当区人民医院，贵州 贵阳550018；2．贵州省人民医院，贵州 贵阳550002）

近年来，随着我国经济的飞速发展，人们生活水平的不断改善。但是由于长期以来不合理的饮食习惯，例如长期大量摄入富含脂肪的肉类（猪肉）以及激素等食物［1］，导致我国由于高血脂引发的动脉粥样硬化，冠心病以及高血压等疾病发病率呈现出逐年升高的趋势。目前上述疾病已经成为危害中老年人健康的主要疾病，并且其发病人群逐渐向青壮年群体迁移。对于上述疾病目前主要通过服用他汀类，烟酸类药物进行治疗，虽然上述药物具有较好的疗效，但在部分患者引发失眠，抑郁等副作用，对长期服用的中老年人带来严重的二次伤害［2］。近年来相关研究指出，多酚类化合物对于心脑血管具有重要的保护作用，浆果类食物由于其本身富含多酚类化合物，因此逐渐引起研究人员兴趣［3］。研究发现，红树莓（rubus idaeus）提取物中含有大量的多酚类抗氧化物，并且临床研究发现，长期服用红树莓浆果可以显著改善高血脂以及心脑血管疾病患者病情［4］，但是，目前对于红树莓浆果改善高血脂以及心脑血管疾病的机制尚不清楚，基于此，本研究以ApoE－／－基因敲除小鼠作为研究对象，探究红树莓提取物在改善血脂以及动脉粥样硬化中的作用机制，以期初步阐明红树莓提取物对血脂以及动脉粥样硬化作用机制，为后续研究提供一定的理论以及实验基础。报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本实验中，选取本局饲养的66只16周龄的ApoE－／小鼠作为研究对象，体重为280±20g。饲养条件为室温21±2℃，相对湿度为60%～65%。所有实验操作均符合医学伦理学标准。实验试剂及仪器：红树莓提取物由本实验室制备；血清TG、TAG、NO、SOD、iNOS、GSH、SOD、GPx酶活测定试剂盒，血液抗凝剂购买于Thermo Fisher（US）；低温离心机，酶标仪购买于Eppendorf（Germony）；NF－κB抗体、TNF－α抗体、VCAM－1抗体购于abcam 上海贸易有限公司，其余试剂购买于上海生物工程有限责任公司。

1.2 实验方法 （1）实验动物分组：在本研究当中，将ApoE－／－小鼠随机分为A－F六组，每组11只，其中A 组为对照组（给予相应蒸馏水）、B 组为模型组（给予相应蒸馏水）、C 组为红树莓低浓度（red raspberry－L，2.5g／kg·d）、D 组为红树莓中浓度组（red raspberry－M，5g／kg·d）、E 组为红树莓高浓度组（red raspberry－H，10g／kg·d）、F组为阿托伐他汀钙片组（atorvastatin calcium，0．35mg／kg·d）。（2）模型建立及取材：实验前，对照组每日给予普通饲料喂养3周，模型组、红树莓各浓度组、阿托伐他汀钙片组在HFD（脂肪21%，蛋白质20%，胆固醇0．15%）条件下饲养3周。3周后，对照组及模型组给予等量蒸馏水喂养，红树莓各浓度组给予不同浓度的红树莓提取物喂养，分别为2.5g／kg·d，5g／kg·d，10g／kg·d，阿托伐他汀钙片组给予0．35mg／kg／d的等量阿托伐他汀钙片，期间均给予普通饲料喂养12周。12周后，各组小鼠禁食但不禁水24h。常规麻醉后打开腹腔分离主动脉组织用于染色观察，同时抽取主动脉血液样本5mL，4 ℃1 000 rpm 离心10min后分离血浆与血清，并将其保存于－20 ℃条件下备用［5］。（3）各项生化指标及酶活测定：检测血清中TC、TAG、NO 水平及SOD、iNOS、GSH、SOD、GPx酶活，具体操作均按照相关试剂盒进行；HE 染色以及免疫组化检测参照试剂盒说明书进行。（4）Western－blotting检测：参照Tian H．文献［6－8］检测主动脉组织中NF－κB、TNF－α及VCAM－1的蛋白表达水平。

1.3 统计学方法 对于本研究中所获得相关数据，通过SPAA 20．0 软件进行分析，相关统计资料通用（±s）表示，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 对照组和模型组小鼠主动脉病理学检测 HE 染色结果显示，对照组小鼠主动脉内膜完整平滑，主动脉壁薄厚均匀，无明显增生，未观察到AS斑块的形成（图1A）。与对照组相比，模型组小鼠主动脉壁明显增生，厚度不均匀，主动脉内膜不完整，出现AS病灶（图1B）。

图1 对照组和模型组小鼠主动脉组织HE染色（×100）

2.2 红树莓对ApoE－／－小鼠主动脉斑块的影响 与对照组相比，未经红树莓提取物处理的模型组小鼠中主动脉管壁粥样硬化区域所占比例（27．4±3.8）%与主动脉脂质体区域比例（4.1±1.3）%明显升高；与模型组相比，红树莓各浓度组及阿托伐他汀钙片组主动脉管壁粥样硬化区域比例，以及主动脉脂质体区域比例明显降低差异有统计学意义（P＜0．05）。通过红树莓各浓度组间的比较发现，随着红树莓浓度的升高，小鼠主动脉管壁粥样硬化区域所占比例与主动脉脂质体区域比例呈现下降的趋势，说明红树莓可减少主动脉管壁粥样硬化及脂质体区域的比例，抑制斑块的形成。见表1。为观察红树莓对ApoE－／－小鼠主动脉斑块的影响，本实验对主动脉组织进行免疫组化检测。结果如图2所示，经过高浓度红树莓处理的小鼠（图2B）及经过阿托伐他汀钙片处理的小鼠（图2C）主动脉中，病变细胞数显著少于模型组中未经过红树莓处理的小鼠（图2A），差异有统计学意义（P＜0．05）。这表明，红树莓可以在一定程度上抑制主动脉内脂肪堆积，

表1 不同处理组动脉粥样硬化区域以及脂质体区域的比较

图2 ApoE－／－小鼠主动脉免疫组化检测结果

2.3 红树莓对ApoE－／－小鼠血脂水平的影响 由表2可知，模型组小鼠血清TC为22.84±2.95mmol／L，TAG 为（9．48±1.33）mmol／L。与模型组相比，红树莓各浓度组及阿托伐他汀钙片组的小鼠血清中TC与TAG 水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0．05）。红树莓各浓度组与阿托伐他汀钙片组相比较，血清TC 和TAG 的差异无统计学意义（P＞0．05）。通过红树莓各浓度组间的比较发现，红树莓浓度越高，小鼠血清TC 和TAG 的水平越低。结果说明红树莓可以显著降低ApoE－／－小鼠血清TC以及TAG 的含量，且其抑制效果与阿托伐他汀钙片相似。

表2 红树莓不同浓度组对ApoE－／－小鼠血脂水平的比较

2.4 红树莓对ApoE－／－小鼠NO、iNOS、GSH，SOD以及GPx活性的影响 与对照组相比，模型组小鼠血液中NO、iNOS、GSH，SOD 以及GPx活性显著下降。与模型组相比较，红树莓低、中、高浓度组和阿托伐他汀钙片浓度组中NO、iNOS、GSH，SOD 以及GPx 活性显著升高，差异有统计学意义（P＜0．05）。相关研究表明，NO 在细胞内可以参与氧化胁迫相应信号转导进程［9］，且图2显示经红树莓各浓度处理后的ApoE－／－小鼠体内过氧化物清除相关酶的活性升高，说明了红树莓可能通过提高血液中相关酶活进而参与相关氧化胁迫反应。

图3 红树莓对ApoE－／－小鼠NO、iNOS、GSH、SOD 以及GPx活性的影响

图4 各组小鼠主动脉NF－κB、TNF－α及VCAM－1蛋白的表达

2.5 红 树 莓 对ApoE－／－小 鼠NF－κB 、TNF－α 及VCAM－1蛋白水平的影响 通过Western－blotting方法，测定不同红树莓浓度组小鼠内NF－κB、TNFα及VCAM－1蛋白的表达水平。与模型组相比，红树莓各浓度组与阿托伐他汀钙片组的小鼠体内NFκB、TNF－α及VCAM－1的蛋白水平均表现为下降，差异具有统计学意义（P＜0．05）。此外，红树莓各浓度组间对比发现，随着红树莓浓度的升高，小鼠体内NF－κB、TNF－α及VCAM－1的蛋白水平呈下降趋势，说明NF－κB、TNF－α及VCAM－1的蛋白水平与红树莓的浓度表现为负相关。见图3。

3 讨 论

动脉粥样硬化（AS）是一种慢性炎性疾病，与心肌梗塞等心脑血管疾病的许多危险因素有关［10］。目前，动脉粥样硬化由于高发病率，降低寿命等原因，已成为全球范围内公共卫生问题［11］。AS病理变化以血管内壁脂质斑形成为特征，导致管腔狭窄、硬化，进而影响组织血供。本研究利用ApoE－／－小鼠建立AS模型，使用不同浓度的红树莓持续干预12周，结果显示，与模型组相比，红树莓各浓度组主动脉管壁粥样硬化区域比例与主动脉脂质体区域比例明显减少，血脂水平有所下降，提高了NO、iNOS、GSH 等过氧化物清除相关酶的活性，且抑制NF－κB、TNF－α及VCAM－1 的蛋白水平。说明红树莓可通过提高血液中相关酶活来参与相关氧化胁迫反应，进而改善动脉粥样硬化。

红树莓也称木莓，通过对其提取物中相关成分的研究发现，红树莓提取物中含有丰富的抗癌物质例如鞣化酸等［12］，目前研究发现，该类物质对于多种肿瘤以及癌症具有显著的疗效。相关临床研究结果发现，鞣化酸在人体内较易被吸收进入血液系统，从而在体内发挥一定的作用［13］。研究发现，鞣化酸在体内可以显著抑制癌细胞等对周围组织细胞的损害，单手其具体机制目前尚不清楚［14－17］。红树莓除了富含抗癌物质鞣化酸外，还含有大量的多酚类抗氧化物。有研究发现，长期服用红树莓浆果可以显著改善高血脂以及心脑血管疾病患者病情［4］。在本研究当中，我们首次利用ApoE－／－小鼠研究红树莓是否对小鼠体内血脂及动脉粥样硬化具有显著疗效。结果表面其可以显著降低主动脉粥样硬化区域所占比例，同时亦可以显著降低主动脉细胞中脂肪颗粒含量，进而降低主动脉粥样硬化的恶化进程，且与阿托伐他汀钙片处理组相比，其效果并无显著差异。并且本研究首次通过测定经过红树莓提取物处理的ApoE－／－小鼠体内NO 等含量证明，红树莓提取物处理的小鼠其体内NO 等相关信号分子等的含量显著升高，同时相关研究结果表明，NO 在体内可以参与一系列氧化胁迫进程，例如其可以通过激活相关抗氧化系统来降低细胞内过氧化物的含量进而对细胞祈祷保护作用。

本次研究首次发现，红树莓可增加NO 含量导致下游相关的超氧阴离子清除酶例如GSH，SOD以及GPx火星显著升高，从而降低细胞内过氧化物以及其它超氧阴离子含量进而对主动脉细胞起到一定保护作用，此外还通过干扰NF－κB／VCAM－1通路，抑制平滑肌细胞的迁移、减轻炎症和减少主动脉管壁粥样硬化区域与主动脉脂质体区域，进而发挥抗动脉粥样硬化的作用。本研究对红树莓浆果改善高血脂以及心脑血管疾病的机制提供了理论依据，为动脉粥样硬化的治疗提供了新思路。